多發(fā)性硬化癥顯像劑11C-CIC的合成

張錦明，張曉軍，黃德暉，王 卉，劉 健，田嘉禾

（1.解放軍總醫(yī)院 核 醫(yī)學(xué)科，北京 100853；2.解放軍總醫(yī)院 神 經(jīng)內(nèi)科，北京 100853）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種慢性、炎癥性、脫髓鞘的中樞神經(jīng)（CNS）疾病，病理改變?yōu)榇竽X和脊髓的神經(jīng)髓鞘斑塊性的破壞，由于PET缺少特異性顯像劑，目前影像學(xué)診斷MS以MRI為主。與MRI相比，PET／CT診斷MS靈敏性更高，18F-FDG結(jié)果表明，與正常人相比，MS病人整腦的FDG攝取降低了3%～18%，攝取降低的主要區(qū)域?yàn)槠雍桶踪|(zhì)［1］。但在穩(wěn)定的 MS病人中，由于大面積的髓鞘斑塊，F(xiàn)DG攝取反而增高，增加了MS鑒別診斷的難度。Stankoff等［2］發(fā)現(xiàn)用于早老癡呆（AD）診斷的剛果紅可與CNS的髓磷脂結(jié)合，因此用診斷AD的11C-PIB用于診斷MS，經(jīng)二例患者的動(dòng)態(tài)PET顯像表明，可以定量分析脫髓鞘情況。最新研究表明［3］，11C-PIB在髓磷脂密度很高的區(qū)域的放射性分布很低，不適用于研究MS。因此，MS顯像劑的特異性是關(guān)鍵問題。2006年，Wu CY等［4］研制第一個(gè)靶向髓磷脂 （myelin）的PET顯像劑4－（4-（4-氨 基 苯 乙 烯基）-2，5-二 甲 氧 基苯乙烯基）-［N-甲基－11碳］苯胺（11C-CIC），體外研究表明CIC與CNS的髓磷脂結(jié)合，而與髓鞘斑塊不結(jié)合。經(jīng)MS動(dòng)物模型證實(shí)，11C-CIC能特異性反映髓鞘病變的范圍和程度，甚至在功能代償期而病理尚未出現(xiàn)明顯變化時(shí)就已發(fā)現(xiàn)攝取異常。隨后比較了11C-CIC與其他MS顯像劑的區(qū)別，認(rèn)為11C-CIC在診斷MS方面有一定的價(jià)值［5－6］。Wang YM 采用碘代甲烷與 CIC前體反應(yīng)，在弱堿條件下甲基化，但甲基化效率不高［7］。本研究嘗試用活性更高的Triflate-CH3作甲基化試劑，自動(dòng)化合成了11C-CIC，提高合成效率，同時(shí)研究其體外穩(wěn)定性，并進(jìn)行Micro PET／CT顯像研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

HM-20回旋加速器：日本住友重機(jī)械株式會(huì)社；PET自動(dòng)化碳-11多功能合成模塊：內(nèi)置液相碘代甲烷、Triflate在線轉(zhuǎn)換、甲基化和HPLC純化（配紫外和放射性檢測(cè)器）及固相萃取等設(shè)備：派特（北京）科技公司；分析HPLC儀，配Biocan Flow Count放射性檢測(cè)器和2487紫外檢測(cè)器，C-18柱：美國(guó) Waters公司；1 mol／L的氫化鋰鋁四氫呋喃溶液：德國(guó)，ABX公司；57%HI：AR，美國(guó)Acros公司；100 g／L的Vc溶液：美國(guó) Mc Guff公司；乙醇（USP級(jí)，美國(guó)Milenniu m公司；丙酮：AR，美國(guó)Sigma公司；前體：4-（4-（4-氨基苯乙烯基）-2，5-二甲氧基苯乙烯基）-苯胺和標(biāo)準(zhǔn)品4-（4-（4-氨基苯乙烯基）-2，5-二甲氧基苯乙烯基）-［N-甲基］苯胺：美國(guó)Case大學(xué)Wang YM教授贈(zèng)送；e XPlore Vista小動(dòng)物PET／CT成像系統(tǒng)：美國(guó)GE公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 在線轉(zhuǎn)換11 C-CH3－Triflate

采用 H M-20加速器經(jīng)14N（p，α）11C反應(yīng)，在靶內(nèi)生成11CO2。將11CO2傳到浸于液氮中的LOOP環(huán)（0.3 mm×5 000 mm）上，11CO2經(jīng)LOOP時(shí)被固化成干冰滯留在LOOP環(huán)內(nèi)。自動(dòng)化碳-11多功能合成模塊合成11C-碘代甲烷，LOOP環(huán)脫離液氮后經(jīng)空氣加熱，干冰重新轉(zhuǎn)化成氣態(tài)的11CO2，由40 mL／min的氮?dú)鈱?1CO2輸送到含0.2 mL 1 mol／L的氫化鋰鋁四氫呋喃（T HF）溶液的反應(yīng)管中，11CO2與氫化鋰鋁反應(yīng)生成復(fù)合鹽，復(fù)合鹽與氫碘酸反應(yīng)生成碳-11碘代甲烷。由氮?dú)鈱⑻?11碘代甲烷載帶入已加熱到200℃不銹鋼管（10 mm×70 mm），管內(nèi)有0.4 g三氟甲基磺?；y與0.65 g石墨混合物，碳-11碘代甲烷在線轉(zhuǎn)換成11C-CH3－Triflate［8］，進(jìn)入下一反應(yīng)瓶。

2.2 11 C-CIC的合成

將11C-CH3－Triflate通入到新配制含1～2 mg的去甲基CIC前體的200μL丙酮溶液內(nèi)，反應(yīng)瓶冷卻到6℃左右，觀察R4的放射性計(jì)數(shù)，待R4的放射性計(jì)數(shù)達(dá)到最大，停止通入11C-CH3－Triflate。反應(yīng)瓶在室溫或加熱到90℃，維持3 min。將V14瓶?jī)?nèi)HPLC流動(dòng)相液體加到反應(yīng)瓶終止反應(yīng)，并液體轉(zhuǎn)移到半制備 HPLC柱（Alltech C-18 10 mm×150 mm）上純化（圖1中D部分）；流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（水）＝8∶2的溶液，流速為5 mL／min，收集7～8 min的放射性液體，將收集的放射性液體與60 mL注射用水混合，混合液過Sep-Pak C-18柱（Sep-Pak C-18柱預(yù)先用10 mL乙醇活化，再用10 mL水清洗），11C-CIC吸附在Sep-Pak C-18柱上，將24號(hào)瓶?jī)?nèi)10 mL水清洗該柱后，用22號(hào)瓶?jī)?nèi)1 mL乙醇將產(chǎn)品從柱上洗脫，并用25號(hào)瓶?jī)?nèi)9 mL生理鹽水稀釋，過無(wú)菌膜即可。

2.3 放化純度

HPLC方法測(cè)量條件為：Waters的HPLC，2487紫外分光光度計(jì)，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；515泵，分析柱為反相Phenomens C-18柱（3.9 mm×150 mm），Bio-Scan的Flow-Count放射性檢測(cè)器。流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（水）＝7∶3的混合溶液，流速為1 mL／min，未反應(yīng)的11C-CH3－Triflate的tR＝2.6 min，11C-CIC的tR＝7.1 min，副產(chǎn)品的tR＝4.4 min。

圖1 11 C-CIC的化學(xué)合成模塊Fig.1 The chemical module of radio-synthesis for 11 C-CIC

圖2 合成11 C-CIC線路圖Fig.2 Scheme of 11 C-CIC synthesis

2.4 11 C-CIC體外穩(wěn)定性

將最后形成的含10%乙醇、濃度為300 TBq／L的11C-CIC室溫放置，每間隔10 min用 HPLC測(cè)量11C-CIC的放化純度。從SEP-PAK C-18柱上淋洗下來(lái)的11C-CIC乙醇溶液，用100 g／L的Vc和生理鹽水溶液稀釋，最終得含10%乙醇及10 g／L Vc、濃度為300 TBq／L的11C-CIC，相同方法測(cè)放化純度。

2.5 11 C-CIC在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

取20±2 g的NH雄性小鼠（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心提供）20只，編號(hào)后計(jì)算機(jī)隨機(jī)分成4組，尾靜脈注射11C-CIC 的3.7 MBq／0.1 mL，于注射后5、15、30、60 min分別處死小鼠，取血、心、肝、腦等主要器官，稱重并在井型計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)，計(jì)算各器官的放射性攝取率（ID%／g）。

2.6 Micro PET／CT顯像

NH小鼠和SD正常大鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供）2只。腹腔注射5%的水合氯醛麻醉，注射后30 min置于e Xpl ore Vista Micr o PET／CT上掃描，NH小鼠行全身掃描，大鼠僅做頭部掃描。先行PET再行CT以定位，確定放射性濃集的部位。

3 結(jié)果與討論

3.1 11 C-CIC的合成

從4-（4-（4-氨基苯乙烯基）-2，5-二甲氧基苯乙烯基）-苯胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，其分子式上有二個(gè)對(duì)稱的苯胺；苯胺很容易發(fā)生甲基化反應(yīng)，如11C-PIB的合成，在室溫下甲基化效率高達(dá)65%。Ono M等［9］采用的順式二苯乙烯胺也可以在室溫下與11C-Triflate-CH3反應(yīng)。但本研究中CIC前體在丙酮或DMSO等溶劑中，在常溫下不發(fā)生甲基化反應(yīng)，加熱后才能發(fā)生反應(yīng)，可能是受兩個(gè)共軛健影響。

圖3a為經(jīng)半制備HPLC純化11C-CIC的放射性色譜圖分析，流動(dòng)相為60%的乙腈，在4.0 min到15 min處一個(gè)較大的放射性峰，該峰不是11C-Triflate-CH3，而是其他雜質(zhì)。收集16 min處的放射性液體，HPLC分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品的放化純度很低，出現(xiàn)了多個(gè)雜質(zhì)峰（圖3b），說(shuō)明60%的乙腈作半制備的流動(dòng)相不合適。分別采用60%、70%和80%的乙腈作流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)升高乙腈的濃度，縮短了產(chǎn)品在HPLC柱上的保留時(shí)間，雜質(zhì)峰隨濃度升高而降低。采用80%乙腈作HPLC流動(dòng)相分離，最終產(chǎn)品的放化純度仍低于95%。

3.2 11 C-CIC體外穩(wěn)定性

采用不同濃度的乙腈作流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)提高流動(dòng)相中乙腈的濃度，產(chǎn)品在HPLC柱上的保留時(shí)間縮短，雜質(zhì)峰面積隨乙腈濃度升高而降低，分析收集到產(chǎn)品的放化純度，產(chǎn)品的放化純度隨流動(dòng)相中乙腈的上升而提高，說(shuō)明可能產(chǎn)品在Semi-HPLC分離過程中分解。最終產(chǎn)品經(jīng)SEP-PAK C-18柱固相萃取，加入10%的乙醇，室溫放置；產(chǎn)品在常溫下分解很快，說(shuō)明11C-CIC體外不穩(wěn)定。文獻(xiàn)在合成18F-W372中加入抗壞血酸以提高體外穩(wěn)定性［10］，在分離11C-CIC的HPLC流動(dòng)相中加入10 g／L的抗壞血酸，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)峰面積下降（圖4a），同時(shí)收集半成品的放化純度大于99%（圖4b），與圖3b相比，在3～5 min的雜質(zhì)峰消失，說(shuō)明10 g／L的抗壞血酸防止了11C-CIC的分解。在最終產(chǎn)品中加入10 g／L抗壞血酸，室溫放置，觀察60 min，產(chǎn)品11C-CIC的放化純度仍大于99%，體外穩(wěn)定性良好。

圖3 11 C-CIC的HPLC放射性色譜圖a——purification of Semi-HPLC（60%acetonitrile as mobile）；b——analysis HPLC（60%acetonitrile as mobile）Fig.3 Radio-chromatogram of 11 C-CIC

圖4 11 C-CIC的HPLC放射性色譜圖a——purification of Semi-HPLC（80%acetonitrile and 10 g／L Vc as mobile）；b——sanalysis HPLC（70%acetonitrile as mobile）Fig.4 Radio-chromatogram of 11 C-CIC

3.3 11 C-CIC的質(zhì)量控制

分析HPLC放射性色譜圖表明（圖4b），11C-CIC的放化純度大于99%，幾乎無(wú)放射性雜質(zhì)；紫外未見有前體存在。共進(jìn)CIC標(biāo)準(zhǔn)品的UV保留時(shí)間表明，放射性峰與標(biāo)準(zhǔn)品在HPLC上有相同的保留時(shí)間，證實(shí)放射性物質(zhì)為CIC。由于CIC中共軛的作用，產(chǎn)品呈淡綠色，紫外吸收峰較強(qiáng)（產(chǎn)品中吸光度達(dá)0.013 AU）。

3.4 11 C-CIC的自動(dòng)化合成

采用全自動(dòng)合成模塊，從11CO2開始到產(chǎn)品合成全部耗時(shí)25 min，合成效率為55%～65%（n＞10）。圖4a為Semi-HPLC純化11CCIC的放射性色譜圖，可見，在2.5～4.5 min之間為未反應(yīng)的Triflate-甲烷，產(chǎn)品峰在5～6 min之間。半制備的紫外檢測(cè)前體在保留時(shí)間tR＝3.5～4.5 min時(shí)出現(xiàn)，前體被分離，因此產(chǎn)品中沒有檢查到前體。采用HM-20回旋加速器加速器，束流為40μA，轟擊12 min，最終得到3.3 GBq的11C-CIC，比活度為60 TBq／mol。

3.5 11 C-CIC在正常小鼠體內(nèi)生物分布

11C-CIC在正常小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表1。經(jīng)尾靜脈注射11C-CIC后，血液清除很快，到5 min時(shí)，為（1.86±0.66）%ID／g，到10 min 時(shí) 下 降 到 （0.43±0.21）%ID／g，5 min與30 min放射性攝取比為10.9；放射性主要分布在肝、脾和腎內(nèi)，30 min在肝內(nèi)放射性仍較高，清除較慢，可能與其脂溶性高有關(guān)，全腦攝取較高，在5 min時(shí)達(dá)（2.78±0.02）ID%／g，到30 min時(shí)為（0.52±0.05）%ID／g，5 min與30 min放射性攝取比為5.3，腦內(nèi)有較好的滯留。

表1 11 C-CIC在正常小鼠體內(nèi)的生物分布Table 1 The biodistribution of 11 C-CIC in the nor mal NH mice

3.6 Micro PET顯像

11C-CIC在正常NH小鼠的PET顯像見圖5a，放射性主要集中于肝內(nèi)，雙肺區(qū)放射性較高，肌肉及大腦內(nèi)有放射性攝取，該顯像與生物學(xué)分布一致。大鼠的腦PET顯像見圖5b，可見30 min時(shí)大腦內(nèi)有明顯的放射性攝取，攝取區(qū)域?yàn)槭竽X白質(zhì)區(qū)（圖5b中白色箭頭），該攝取即為11C-CIC與CNS白質(zhì)區(qū)髓磷脂結(jié)合。

圖5 11 C-CIC在正常NH鼠和SD大鼠顯像a——Whole body PET i maging of NH mice；b——Brain PET i maging of SD ratFig.5 The PET i maging of 11 C-CIC in NH mice and SD rat

4 結(jié)論

本研究自動(dòng)化合成了11C-CIC，研究了其體外穩(wěn)定性并進(jìn)行Micro PET顯像。在半制備HPLC流動(dòng)相及終產(chǎn)品加入10 g／L的抗壞血酸，能有效防止11C-CIC的體外分解。11C-CIC能進(jìn)入鼠大腦，并被正常的腦白質(zhì)攝取，提示11C-CIC有可能成為髓鞘斑潛在顯像劑。

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