125I標(biāo)記的二噻吩查爾酮類Aβ斑塊顯像劑的制備與生物評(píng)價(jià)

彭 程，崔孟超，梁志剛，劉亭廷，張曉陽

（1.首都醫(yī)科大學(xué) 宣 武醫(yī)院，北京 100053；2.放射性藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北 京師范大學(xué) 化 學(xué)學(xué)院，北京 100875）

阿爾茲海默癥（AD）是一種常見癡呆癥，Aβ斑塊是其重要病理學(xué)特征之一［1］，以之為靶點(diǎn)開發(fā)放射性分子探針，進(jìn)而通過PET或SPECT核醫(yī)學(xué)顯像技術(shù)有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)AD的早期診斷［2］。近年來已經(jīng)有多個(gè)用于PET顯像的Aβ斑塊分子探針得到美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用，而用于SPECT顯像的Aβ斑塊分子探針的研發(fā)則滯后，至今只有［123I］I MPY進(jìn)入過臨床實(shí)驗(yàn)［3］。2005年，Nesterov等［4］報(bào)道了一個(gè)含有二噻吩結(jié)構(gòu)單元的小分子（NIAD-4）作為檢測(cè)Aβ斑塊的近紅外光學(xué)探針，隨后Nilsson等［5］報(bào)道了一系列多聚噻吩衍生物（LCPs）作為對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象敏感的光學(xué)探針，這兩類探針不僅在體外與Aβ聚集體具有很高的親和力，而且能有效通過血腦屏障，與AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊結(jié)合。此后，崔孟超等［6－7］報(bào)道了兩類含有二噻吩結(jié)構(gòu)的 Aβ斑塊顯像劑，分別將二噻吩結(jié)構(gòu)單元與苯并噻唑和苯乙烯這兩類經(jīng)典的Aβ斑塊分子探針骨架結(jié)構(gòu)相連，并進(jìn)行了125I放射性標(biāo)記，體內(nèi)外生物評(píng)價(jià)均顯示優(yōu)良性質(zhì)。可見二噻吩結(jié)構(gòu)單元在與Aβ斑塊結(jié)合的過程中可能起著非常重要的作用。近年來，Ono等報(bào)道了一系列放射性標(biāo)記的查爾酮（Chalcone）衍生物作為Aβ斑塊顯像劑，大多具有對(duì)Aβ聚集體較高的親和力，而且在正常小鼠腦內(nèi)具有較高的初始攝取，查爾酮成為一類新型的Aβ斑塊分子探針骨架結(jié)構(gòu)［8－10］。

本研究擬利用組合化學(xué)原理，將二噻吩結(jié)構(gòu)單元與查爾酮結(jié)構(gòu)連接，設(shè)計(jì)并合成兩個(gè)鹵代二噻吩查爾酮衍生物作為Aβ斑塊顯像劑，利用體外熒光染色實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其與Aβ聚集體的親和力，對(duì)碘代化合物進(jìn)行125I放射性標(biāo)記，并進(jìn)行體外放射自顯影實(shí)驗(yàn)和正常小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)。

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑和儀器

4－甲氧基苯乙酮：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；化合物2，3參照文獻(xiàn)［6］制備；Na125I（2 200 Ci／mmol）：美國(guó) Perkin-El mer公司；硫磺素-S：Sig ma-Al drich公司；Aβ1－42多肽：日本Osaka peptide institute（三氟乙酸鹽形式）；其他試劑均購(gòu)自北京化工廠。

400 MHz核磁共振譜儀：Bruker AvanceⅢ；質(zhì)譜儀：Ther mo Surveyor MSQ Plus（EI）；SCL-10 AVP型高效液相色譜儀：配有Packard 500 TR型γ射線閃爍檢測(cè)器，島津；奧泰-626型高效液相色譜儀：配有LINEAR UVIS-201型紫外檢測(cè)器以及BIOSCAN型γ射線閃爍檢測(cè)器；Agilent TC-C18反相柱（5μm，4.6 mm×150 mm）；Alltech C18反相柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；Axio Oberver Z1（Zeiss，Ger many）熒光顯微鏡，Per kin-El mer儲(chǔ)磷屏成像系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常小鼠：ICR，5周，雄性，購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。轉(zhuǎn)基因小鼠：C57BL6，APP-swe／PSEN1，12月齡，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 穩(wěn)定化合物及標(biāo)記前體的合成

合成路線及標(biāo)記方法如圖1所示。

2.1.1 （E）-3-（5-［5′-溴-2，2′-二噻吩）-1-（4-甲氧基苯基）-2-烯-1-丙酮 （化合物4）

稱取150 mg對(duì)甲氧基苯乙酮（化合物1，1.0 mmol）和273 mg溴代二噻吩醛（化合物2，1.0 mmol）溶于50 mL乙醇中，滴加50μL氫氧化鈉水溶液（1 mol／L）；室溫下攪拌30 min后有大量橙色固體析出；抽濾，并用20%乙醇水溶液洗滌三次，干燥后得到295 mg橙色化合物，產(chǎn)率為73%。

圖1 合成路線及標(biāo)記方法Fig.1 Synthetic route and r adiolabeling method

2.1.2 （E）-3-（5-［5′-碘-2，2′-二噻吩］）-1-（4-甲氧基苯基）-2-烯-1-丙酮（化合物5）

制備方法與化合物4類似，化合物1與化合物4反應(yīng)，干燥后得到132 mg橙色化合物，產(chǎn)率為86%。

2.1.3 （E）-3-（5-［5′-三 丁 基 錫-2，2′-二 噻吩］）-1-（4-甲 氧 基 苯 基）-2-烯-1-丙 酮 （化 合物6）

將121 mg化合物4（0.3 mmol）、0.3 mL六正丁基二錫和35 mg四（三苯基磷）鈀（0.03 mmol）溶于10 mL甲苯中（含1 mL三乙胺）。110℃油浴中攪拌加熱反應(yīng)10 h。減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）＝4∶1得到50 mg黃色蠟狀固體，產(chǎn)率為27%。

2.2 放射性標(biāo)記及生物評(píng)價(jià)

2.2.1 ［125I］5的制備

稱取0.1 mg錫標(biāo)記前體化合物6于安剖瓶中，加入100μL乙醇溶解，用微量進(jìn)樣器加入約4μL［125I］NaI溶液（300μCi，比活度：542.7 TBq／g）。依次加入50μL H2O2（3%），100μL鹽酸（1 mol／L）。密閉后室溫下反應(yīng)15 min后，加入50μL飽和亞硫酸氫鈉溶液終止反應(yīng)，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)p H至中性。乙酸乙酯萃?。?×1 mL）分液，有機(jī)相用氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉?00μL乙醇溶解后進(jìn)HPLC分離，分離條件為：Alltech C18 analytical col u mn（4.6 mm×250 mm）；CH3CN／H2O＝9／1；流速1.0 mL／min。

收集含有目標(biāo)物的流出液，旋蒸除去溶劑，將得到的標(biāo)記配體溶于少量乙醇并用生理鹽水配制成所需要的濃度置于－20℃中存儲(chǔ)待用。最后通過HPLC分析125I標(biāo)記配體與參比化合物的保留時(shí)間。［125I］5的分析條件如下：Agilent TC-C18 analytical colu mn（4.6 mm×150 mm）；V（CH3CN）∶V（H2O）＝9∶1；流速1.0 mL／min。

2.2.2 體外熒光染色

轉(zhuǎn)基因小鼠及正常小鼠大腦石蠟切片（8μm）依次經(jīng)過3×20 min的二甲苯脫蠟，2×5 min 100%乙醇，2×5 min 95%乙醇，5 min 80%乙醇和5 min 70%乙醇洗滌，流水沖洗10 min后，浸于化合物4或5（1μmol／L，20%乙醇）溶液中10 min，切片經(jīng)過50%乙醇洗滌2 min、去離子水洗滌2 min后，采用熒光微鏡觀察，使用GFP濾鏡。硫磺素-S對(duì)照染色與上述方法相同，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%的硫磺素-S水溶液。

2.2.3 體外放射自顯影

轉(zhuǎn)基因小鼠腦石蠟切片及對(duì)照正常小鼠腦石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，滴加純化后的［125I］5溶液（約370 k Bq／100μL），室溫下孵育60 min。用40%的乙醇溶液沖洗切片3 min，干燥后在磷屏上曝光6 h后進(jìn)行成像分析。同一切片經(jīng)過硫磺素-S染色后與放射自顯影實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。

2.2.4 體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)

硅烷玻璃試管中依次加入放射配基（［125I］TZDM，100 000 min－1／100μL，10%乙醇），化合物4或5溶液（終濃度范圍：10－4～10－11mol／L），Aβ1－42聚集體（終濃度：28 n mol／L），用PBS（含10%乙醇）定容至1 mL；37℃水浴中震蕩孵育2 h；細(xì)胞收集器分離結(jié)合復(fù)合物與游離放射配基（GF／B濾紙用0.5%PEI浸泡2 h）；Wizard 1470型伽瑪計(jì)數(shù)儀測(cè)定濾膜上放射性計(jì)數(shù)；利用Graph Pad Pris m 4.0分析數(shù)據(jù)得到半抑制常數(shù)IC50；根據(jù)Cheng-Prusoff方程計(jì)算抑制常數(shù)Ki＝IC50／（1＋［L］／Kd）［11］。

2.2.5 正常小鼠體內(nèi)生物分布

將5μCi純化后的［125I］5（100μL生理鹽水，含10%乙醇）由尾靜脈注射入四組正常ICR小鼠體內(nèi)（n＝5），分別于2、30、60、120 min斷頭處死，解剖取出其臟器，測(cè)量臟器濕重及放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算其放射性百分計(jì)量（%ID／organ）及每克臟器中的放射性攝取率（%ID／g）。

3 結(jié)果與討論

3.1 穩(wěn)定化合物及標(biāo)記前體的合成

合成的化合物均經(jīng)過核磁共振（1H NMR）與質(zhì)譜（EI-MS）的表征。

（1）化合物4的表征。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ8.02（d，J＝8.8 Hz，2 H），7.86（d，J＝15.2 Hz，1 H），7.30（d，J＝15.2 Hz，1 H），7.23（d，J＝3.5 Hz，1H），7.08（d，J＝3.7 Hz，1H），7.03－6.95（m，4 H），3.89（s，3 H）.MS（EI）：m／z calcd f or C18H13Br O2S2403.95；f ound 404.13。

（2）化合物5的表征。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ8.02（d，J＝8.9 Hz，2 H），7.86（d，J＝15.4 Hz，1 H），7.29（d，J＝15.2 Hz，1 H），7.23（d，J＝3.8 Hz，1 H），7.19（d，J＝3.8 Hz，1 H），6.98（d，J＝8.9 Hz，1 H），6.92（d，J＝3.8 Hz，1 H），3.90（s，3 H）.MS（EI）：m／z calcd f or C18H13IO2S2451.94；f ound 452.04。

（3）化合物6的表征。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ7.40（d，J＝7.9 Hz，2 H），7.21（d，J＝5.0 Hz，1 H），7.18（d，J＝2.7 Hz，1 H），7.07（s，1 H），7.04（d，J＝15.4 Hz，1 H），6.92（d，J＝3.7 Hz，1 H），6.89（d，J＝8.0 Hz，2 H），6.85（d，J＝15.2 Hz，1 H），3.83（s，3 H），1.73－1.58（m，6 H），1.41－1.28（m，6 H），1.06－1.20（m，6 H），0.92（t，J＝7.3 Hz，9 H）.MS（EI）：m／z calcd for C30H40O2S2Sn 616.15；found 616.53。

3.2 ［125I］5的制備

經(jīng)過錫－鹵交換法成功進(jìn)行了125I標(biāo)記，標(biāo)記率大于99%，通過HPLC分離純化去除標(biāo)記前體及無機(jī)鹽等雜質(zhì)后得到［125I］5，經(jīng)HPLC分析其放化純度大于99%。［125I］5與穩(wěn)定化合物5在相同條件下進(jìn)行HPLC共進(jìn)樣分析，二者保留時(shí)間分別為4.28 min和4.80 min，能夠很好地匹配，［125I］5的結(jié)構(gòu)得到認(rèn)證。

3.3 體外熒光染色

所合成化合物4和5均能清晰地標(biāo)記出轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片上Aβ斑塊的位置，而且可以與相鄰切片經(jīng)硫磺素-S染色的結(jié)果對(duì)應(yīng)（見圖2），表明兩個(gè)化合物與Aβ斑塊均有較好的親和力和選擇性。

圖2 化合物4（a）和5（c）在轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片上的熒光染色結(jié)果t he adjacent sections were stained wit h t hio avin-S（b，d）.（10×magnification）Fig.2 Fluorescence staining of 4（a）and 5（c）on brain sections from Tg mouse

3.4 體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)

以［125I］TZDM為放射性配基進(jìn)行的體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，合成的化合物4和5均能對(duì)［125I］TZDM 與 Aβ1－42聚集體的結(jié)合產(chǎn)生顯著的抑制作用（見圖3），經(jīng)過定量計(jì)算得到化合物4和5的Ki值分別為2.33 n mol／L和0.88 n mol／L，表明兩個(gè)化合物對(duì) Aβ1－42聚集體均有很高的親和力，且碘代化合物5比溴代化合物4的親和力更高，因此，選擇化合物5進(jìn)行進(jìn)一步的125I標(biāo)記和生物評(píng)價(jià)。

3.5 體外放射自顯影

標(biāo)記化合物［125I］5在轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片上有明顯的放射性濃集（圖4），而同齡正常小鼠腦切片上無放射性濃集，表明該化合物能與轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊進(jìn)行特異性結(jié)合，且自顯影結(jié)果能與相同切片經(jīng)硫磺素-S染色結(jié)果相對(duì)應(yīng)，表明［125I］5與Aβ斑塊具有較高的親和力和選擇性。

3.6 正常小鼠體內(nèi)生物分布

［125I］5在正常ICR小鼠體內(nèi)的分布如表1所示，標(biāo)記化合物在小鼠腦內(nèi)的2 min初始攝取為（1.19±0.09）%ID／g，到30 min時(shí)即清除至（0.36±0.09）%ID／g，可見其初始腦攝取不是很高，但清除速率較快（2 min與30 min腦攝取比值為3.3）。此外，［125I］5在肝臟中有較高的初始攝取和顯著的代謝。

圖3 化合物4和5對(duì)［125I］TZDM與Aβ1－42聚集體結(jié)合的抑制曲線Fig.3 Inhibition curves for the binding of［125I］TZDM to Aβ1－42 aggregates

圖4 放射性自顯影a——［125I］5；b——t hioflavin-S；c——wild-type mouseFig.4 In vitro autoradiography studies of［125I］5 on brain sections

表1 ［125I］5在正常小鼠體內(nèi)的生物分布（ˉx＋s，n＝5）Table 1 Biodistribution in nor mal mice after i.v.injection of［125I］5（ˉx＋s，n＝5）

3 結(jié)論

本研究成功制備了兩個(gè)鹵代二噻吩查爾酮類Aβ斑塊分子探針，體外熒光染色實(shí)驗(yàn)和體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)均證實(shí)與Aβ1－42聚集體有很高的親和力。通過錫－鹵交換法成功對(duì)碘代化合物5進(jìn)行了125I標(biāo)記，體外放射自顯影實(shí)驗(yàn)顯示［125I］5能夠特異性地標(biāo)記AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦Aβ斑塊，并與硫磺素-S的染色結(jié)果對(duì)應(yīng)。正常小鼠生物分布結(jié)果表明，［125I］5穿過血腦屏障的能力較弱，2 min時(shí)的腦放射性攝取率為1.19%ID／g，與［125I］I MPY相比（2 min腦攝取值為2.88%ID／g）還有很大差距，但腦清除速率較快。綜上所述，［125I］5具有成為Aβ斑塊顯像劑潛力，但需要進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾以提高初始腦攝取。

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