碘標(biāo)記毒死蜱及其在小鼠體內(nèi)的生物分布

刁 堯，廖琳丹，王 姝，姜玉艷，張大龍，任 鵬，段弘燁，孟洪顏，劉 博，石文彬，閻 英，李亞明

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核 醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈 陽 110001；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院PET／CT中心，黑龍江 齊 齊哈爾 161000；3.沈陽市蘇家屯中心醫(yī)院 核 醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈 陽 110100；4.山東麥德盈華科技有限公司，山東 濟(jì) 寧 276000；5.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 放 療科，遼寧 沈 陽 110016）

毒死蜱（Chlor pyrif os，CPF），化學(xué)名稱為0，0-二乙基-0-（3、5、6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯，分子式為C9H11C13NO3PS，相對分子質(zhì)量為350.6，是目前全球使用廣泛的一種有機(jī)磷酸醋類農(nóng)藥，既是殺蟲劑又是除草劑，常溫下毒死蜱為白色結(jié)晶固體，溶點(diǎn)為42.5～43℃。文獻(xiàn)報(bào)道［1－3］毒死蜱具有觸殺、胃毒和熏蒸三重作用，可以通過對乙酰膽堿酯酶（Acetylcholine esterase，ACh E）的抑制引起接觸者中毒。雖然毒死蜱的藥效涉及很多方面，但其在生物體內(nèi)的具體代謝和分布行為的報(bào)道較少，到目前為止，尚未見到用放射性核素標(biāo)記毒死蜱并觀察其生物分布及代謝的文獻(xiàn)報(bào)道，這妨礙了對毒死蜱相關(guān)藥效的深入研究。本研究擬采用靈敏的放射性示蹤法分析毒死蜱在小鼠體內(nèi)的分布特點(diǎn)，以揭示其主要的代謝方式。該方法的建立有助于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測以及毒死蜱代謝機(jī)制研究，同時(shí)對于保證食品安全、維護(hù)人類健康具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料

CPF：Sigma公司（99.9%，HPLC）；Na131I：中國原子能科學(xué)研究院；Iodogen：Sig ma公司；K M 小鼠（SYXK（遼）2008-0005）：中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；γ－計(jì)數(shù)儀（FJ-2008PS）：西安核儀器廠；磷屏成像儀 PMI 170-9400：Bio-Rad，美國；聚酰胺薄膜：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 131I-CPF制備

毒死蜱（CPE）結(jié)構(gòu)式示于圖1。采用Iodogen法對CPF進(jìn)行131I標(biāo)記。標(biāo)記管中預(yù)先涂以Iodogen 50μg，向標(biāo)記管中依次加入50μL的CPF樣品（1 mg／mL，DMSO（二甲基亞砜）溶解），10μL 18.5 MBq Na131I，振蕩反應(yīng)10 min，以生理鹽水溶解，放置備用。以聚酰胺薄膜為支持介質(zhì)，以生理鹽水為第一展開劑，乙酸乙酯和石油醚（體積比2∶1）為第二展開劑，測定其標(biāo)記率、放化純度和比活度。

圖1 Chlorpyrifos的分子結(jié)構(gòu)式（＊ 為131I可能標(biāo)記位點(diǎn)）Fig.1 Chemical structure of Chlorpyrifos（＊labeling site）

1.3 131I-CPF放化純度的鑒定

采用薄層層析法，吸取碘化反應(yīng)液2μL，在距聚酰胺薄膜薄層層析板底端1 c m處點(diǎn)樣，游離131I－作為對照點(diǎn)樣，點(diǎn)樣直徑0.2 c m，冷風(fēng)吹干。生理鹽水為第一展開劑，上行展開，磷屏成像儀成像；乙酸乙酯和石油醚（體積比2∶1）為第二展開劑，上行展開，磷屏成像儀成像。成像結(jié)束后分段剪取聚酰胺層析板，經(jīng)γ放免計(jì)數(shù)儀測量放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算標(biāo)記率、放化純度、放射性比活度和放射性濃度。

標(biāo)記物的標(biāo)記率（%）＝（131I-CPF的計(jì)數(shù)率／點(diǎn)樣量總計(jì)數(shù)率）×100；比活度（TBq／g）＝（放射性核素投入量×標(biāo)記率）／投入的放射性總量；放射性濃度（GBq／L）＝（放射性核素投入量×標(biāo)記率）／標(biāo)記反應(yīng)總體積。

1.4 131I-CPF的純化

采用薄層層析法，聚酰胺薄膜薄層層析板，6 c m×20 c m，距底邊1.5 c m處鉛筆畫線設(shè)為原點(diǎn)，點(diǎn)樣直徑為0.2 c m，冷風(fēng)吹干。生理鹽水為展開劑，上行展開。晾干，磷屏成像儀成像，根據(jù)已知的Rf值，在原點(diǎn)處刮下聚酰胺粉末（吸附有131I-CPF）置于清潔玻璃小瓶中，DMSO溶解，反復(fù)多次，真空泵吹干標(biāo)記物附著于管壁，DMSO助溶，取2μL進(jìn)行薄層層析，鑒定放化純度，純化后的標(biāo)記物的放化純度（%）＝（131I-CPF的計(jì)數(shù)率／點(diǎn)樣量的總計(jì)數(shù)率）×100。

1.5 131I-CPF體外穩(wěn)定性

取50μL純化后的標(biāo)記物分別加入到100μL生理鹽水和新鮮人血清。在37℃下貯存，分別于2、24、48 h取樣，聚酰胺薄膜層析測定放化純度，觀察標(biāo)記物的穩(wěn)定性。

1.6 131I-CPF的小鼠體內(nèi)分布

35只K M小鼠（約20 g，4周齡，雄性）隨機(jī)分為7組（n＝5），各組每只鼠經(jīng)尾靜脈注射200μL131I-CPF（約185 k Bq／只），各組小鼠分別于注射后5、10、30、60、120、240、1 440 min斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨骼、胃、腸、睪丸、腦、脊髓、甲狀腺、頜下腺、血，稱重，測各個(gè)樣品放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織攝取放射性占注入量的百分率（%ID／g）。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 131I-CPF的標(biāo)記率及放化純度

在以聚酰胺薄膜為支持介質(zhì)、生理鹽水為展開劑的體系中，131I-CPF的Rf值為0～0.1，游離的 Na131I的Rf為0.4～0.5；在乙酸乙酯和石油醚（2∶1）為展開劑的體系中，131I-CPF的Rf為0.9～1.0，游離的 Na131I的Rf為0～0.1。經(jīng)測定，兩種體系條件下131I-CPF的標(biāo)記率均為93.5%，放化純度為96.9%，放射性濃度90.24 GBq／L及比活度0.35 TBq／g。

2.2 131I-CPF的體外穩(wěn)定性

131I-CPF在不同體系中、37℃溫度下的穩(wěn)定性結(jié)果示于圖2，由圖2可見，標(biāo)記物分別在人血清和生理鹽水體系中，37℃下放置48 h，標(biāo)記物的放化純度仍大于90%，表明標(biāo)記物在37℃環(huán)境下體外穩(wěn)定性較好。131I的標(biāo)記位點(diǎn)分析，131I可能標(biāo)記在吡啶環(huán)上，即I取代 H（＊ 為可能標(biāo)記位點(diǎn)，圖1）。

圖2 131I-Chlorpyrifos的體外穩(wěn)定性Fig.2 Stability of 131I-Chlor pyrifos in vitr o

131I-CPF薄層層析后磷屏成像分布示意圖示于圖3。

2.3 131I-CPF在小鼠體內(nèi)生物分布

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1。由表1顯示，靜脈注射給藥后131I-CPF在體內(nèi)分布廣泛。血和腎中清除較快，注射后5 min時(shí)即達(dá)峰值，其放射性攝取率分別為37.27%ID／g和8.50%ID／g；心、肝、脾、肺、小腸、大腸、肌肉和頜下腺中分布均較高，注射后10 min時(shí)即達(dá)峰值，其放射性攝取率分別為10.86、6.32、7.97、37.12、8.12、8.15、7.04和7.02%ID／g，而后逐漸下降，表明131I-CPF在體內(nèi)主要經(jīng)肺、肝、脾、腸道和頜下腺代謝；131I-CPF在腦、脊髓和睪丸中亦有一定分布，注射后10 min時(shí)其放射性攝取率分別為4.25、3.41和4.62%ID／g；甲狀腺內(nèi)的放射性隨時(shí)間的延長而逐漸增加，注射后5 min和24 h其放射性攝取率分別為12.99%ID／g和162.21%ID／g。

圖3 131I-Chlor pyrifos薄層層析示意圖Fig.3 Chr omatograms of 131I-Chlor pyrifos

表1 131I-Chlor pyrifos在小鼠體內(nèi)的生物分布，n＝5）Table 1 Biodistribution of 131I-Chlor pyrifos in mice，n＝5）

表1 131I-Chlor pyrifos在小鼠體內(nèi)的生物分布，n＝5）Table 1 Biodistribution of 131I-Chlor pyrifos in mice，n＝5）

組織8.29±0.85 10.86±1.12 2.51±0.18 2.88±0.23 0.64±0.05 0.21±0.02 0.11±0.02肝4.34±3.42 6.32±1.84 2.48±0.27 1.99±0.21 1.25±0.02 0.22±0.04 0.10±0.01脾5.73±0.62 7.94±1.94 2.05±0.31 2.25±0.22 0.54±0.06 0.15±0.01 0.03±0.01肺20.11±3.74 37.12±3.85 6.81±0.81 4.33±0.47 2.35±0.15 1.16±0.13 0.04±0.01腎8.50±3.65 4.58±1.87 4.35±1.17 2.61±0.82 1.48±0.12 0.69±0.01 0.13±0.01胃3.81±0.34 6.18±0.84 5.41±0.57 2.86±0.14 1.55±0.13 0.26±0.02 0.11±0.01小腸 6.09±0.87 8.12±0.95 3.41±0.35 5.45±0.63 1.38±0.12 0.34±0.05 0.05±0.01大腸 5.25±0.42 8.15±0.75 3.34±0.44 2.07±0.24 0.44±0.05 0.13±0.03 0.02±0.01骨2.02±0.32 2.94±0.35 2.04±0.31 1.48±0.18 0.32±0.02 0.09±0.01 0.02±0.01肌6.18±0.95 7.04±1.11 4.48±0.55 3.23±0.43 1.13±0.19 0.61±0.05 0.03±0.01血37.27±4.77 23.76±4.46 13.45±2.55 9.51±2.12 4.17±0.66 1.35±0.18 0.56±0.03腦2.05±0.49 4.25±0.53 3.79±0.42 1.38±0.08 0.52±0.02 0.32±0.01 0.01±0.01脊髓 1.85±0.21 3.41±0.23 2.65±0.16 1.17±0.11 0.32±0.02 0.22±0.01 0.01±0.01頜下腺 4.72±1.23 7.02±2.81 3.92±0.51 2.96±0.64 0.56±0.04 0.14±0.01 0.02±0.01睪丸 1.32±0.12 4.57±0.94 3.12±0.22 1.47±0.13 0.24±0.02 0.11±0.01 0.03±0.01甲狀腺 12.99±4.45 14.58±3.26 22.22±4.58 32.98±5.6不同時(shí)間（min）各組織的放射性攝取率／（%ID·g－1）5 10 30 60 120 240 1 440心6 77.21±9.54 132.36±18.65 163.65±23.54

3 討論

機(jī)體內(nèi)與有機(jī)磷農(nóng)藥代謝密切相關(guān)的膽堿酯酶有乙酰膽堿酯酶（ACh E）、丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase，Bu Ch E，又稱假性膽堿酯酶）和羧酸酯酶（Car boxylesterase）等，其中ACh E又稱真性膽堿酯酶，主要作用于乙酰膽堿，ACh E主要分布于神經(jīng)肌肉組織、紅細(xì)胞及血小板中，是有機(jī)磷農(nóng)藥共同的作用靶點(diǎn)，活性部位絲氨酸殘基與有機(jī)磷結(jié)合后活性被抑制，其活性抑制是有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的主要機(jī)制，也是評價(jià)有機(jī)磷農(nóng)藥中毒程度的一個(gè)重要生物標(biāo)志［4－5］。

毒死蜱進(jìn)入機(jī)體后要先經(jīng)氧化酶的代謝活化作用生成活性中間產(chǎn)物，即毒死蜱氧化物才能作用于靶組織中的ACh E發(fā)揮毒作用，造成膽堿受體功能紊亂，使有膽堿受體的器官功能發(fā)生障礙，氧化后的毒死蜱經(jīng)對氧磷酶（paraoxonase-1，PON-1）等水解酶的作用，降解生成解毒后的代謝產(chǎn)物，即磷酸二乙酯（diethylphosphate，DEP）和3，5，6－三氯-2-吡啶（3，5，6-trichlor opyridinol，TCP）［6－7］。

本實(shí)驗(yàn)制備的131I-Chlorpyrif os標(biāo)記物體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，標(biāo)記后48 h的放化純度大于90%（溶于新鮮人血清中），適于Chlorpyrif os在體內(nèi)外的微量示蹤研究，為下一步研究提供了可靠保障。利用131I-Chlorpyrif os具有靈敏準(zhǔn)確的放射性示蹤特點(diǎn)，可用于觀察分析其在整體生物體內(nèi)的代謝過程和可能的作用靶點(diǎn)。

分布實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，靜脈注射后131IChlor pyrif os在體內(nèi)廣泛分布，主要分布于心、肝、脾、肺、小腸、大腸、肌肉和頜下腺中，其中，以肺分布最多，腎、小腸、大腸、肌肉和頜下腺次之，說明肺臟等諸多器官對Chlorpyrif os具有很高的攝取率，這可能是毒死蜱與肺癌的發(fā)生可能存在某些聯(lián)系的原因之一［8］，腎、肝臟是其主要的代謝臟器，此結(jié)果提示碘標(biāo)131I-Chl orpyrifos可為探討Chlorpyrif os分布代謝的研究提供一個(gè)靈敏的分析方法。Chlor pyrif os在腦、脊髓中亦有一定分布，揭示其能夠透過血腦屏臟（BBB），與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9－11］。

131I-Chlorpyrif os在甲狀腺內(nèi)的放射性隨時(shí)間的延長而逐漸增加，反映出其在體內(nèi)有一個(gè)漸進(jìn)性的脫碘過程，也證明了毒死蜱進(jìn)入體內(nèi)后存在氧化過程；同時(shí)體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示其在生理鹽水中穩(wěn)定，從分子結(jié)構(gòu)分析，其分子結(jié)構(gòu)存在的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)使得整個(gè)分子呈脂溶性，這是分子易于透過BBB的重要原因之一，也是其在生理鹽水中穩(wěn)定的原因之一，所以本實(shí)驗(yàn)采用DMSO溶解效果較生理鹽水好。

以往研究毒死蜱體內(nèi)代謝及分布實(shí)驗(yàn)，大都采用液相色譜等方法，組織樣品處理時(shí)比較繁瑣［5－7］，而用碘標(biāo)的131I-Chl or pyrif os研究代謝實(shí)驗(yàn)時(shí)，組織樣品無需特殊處理，直接測量即可靈敏地反映其在小鼠體內(nèi)的基本代謝過程，若進(jìn)一步結(jié)合其他分子生物學(xué)技術(shù)還可分析其在體內(nèi)精確的代謝行為及可能的作用機(jī)制。

［1］ Ma T，Chambers J E.Kinetic parameters of desulf uration and dearylation of parathion and chlor-pyrif os by rat liver microso mes［J］.Food Chem Toxicol，1994，32（8）：763-767.

［2］ Pond A L，Chambers H W，Coyne C P，et al.Purification of t wo rat hepatic proteins with A-esterase activity toward chlorpyrifos-oxon and paraoxon［J］.J Phar macol Exp Ther，1998，286（3）：1 404-1 411.

［3］ 周志榮，林少彬.血、尿中有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物檢測方法的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊，2007，34（3）：153-157.

［4］ Ti mchalk C，Nolan R J，Mendrala A L，et al.A Physiologically based phar maco-kinetic and pharmacodynamic PBPK／PD model for the organophosphate insecticide chlorpyrifos in rats and humans［J］.Toxicol Sci，2002，66（1）：34-53.

［5］ Ti mchalk C，Poet T S.Develop ment of a physiologically based phar macokinetic and phar macodynamic model to deter mine dosi metry and cholinesterase inhibition for a binary mixture of chlorpyrif os and diazinon in the rat［J］.Neurotoxicol，2008，29（3）：428-443.

［6］ 吳惠，乙楠楠，劉沛，等.大鼠急性經(jīng)口暴露毒死蜱的毒物代謝動力學(xué)和毒物效應(yīng)動力學(xué)研究［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，34（5）：592-596.

［7］ Smith J N，Campbell J A，Busby-Hjerpe A L，et al.Co mparative chlor pyrifos phar macokinetics via multiple routes of exposure and vehicles of ad ministration in the adult rat［J］.Toxicology，2009，261（1-2）：47-58.

［8］ Alavanja M C，Dosemeci M，Samanic C，et al.Pesticides and lung cancer risk in the agricultural health study cohort［J］.Am J Epidemiol，2004，160（9）：876-885.

［9］ Moore C A，Wilkinson S C，Blain P G，et al.Percutaneous absor ption and distribution of organophosphates （chlorpyrif os and dichlorvos）f ollowing der mal exposure and decontamination scenarios using in vitro hu man skin model［J］.Toxicol Lett，2014，229（1）：66-72.

［10］Solo mon K R，Williams W M，Mackay D，et al.Properties and uses of chlorpyrifos in the United States［J］.Rev Envir on Contam Toxicol，2014，231：13-34.

［11］Zhao Q，Dourson M，Gadagbui B.A review of the reference dose f or chlor pyrifos［J］.Regul Toxicol Phar macol，2006，44（2）：111-124.