嚙齒動物上皮祖細(xì)胞與生物材料水凝膠生物相容性的體外研究

薛杉吳鋼羅詩雨張鵬張洪鈿法志強郭燕舞柯以銓徐如祥

·基礎(chǔ)研究·

嚙齒動物上皮祖細(xì)胞與生物材料水凝膠生物相容性的體外研究

薛杉1吳鋼2羅詩雨3張鵬4張洪鈿4法志強1郭燕舞1柯以銓1徐如祥4

目的體外檢測培養(yǎng)細(xì)胞與生物工程水凝膠材料的相互影響，為體外培養(yǎng)細(xì)胞與生物工程水凝膠共移植治療提供理論依據(jù)。方法選擇兩款不同組分的水凝膠Matrigel和PuraMatrix作為實驗材料，以EPCs作為檢測細(xì)胞，將EPCs培養(yǎng)于不同濃度的Matrigel(10%、20%、30%)或PuraMatrix(0.25%、0.5%、1%)表面，或與不同濃度的Matrigel或PuraMatrix混懸培養(yǎng)，于培養(yǎng)的不同時間觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，并用Alamar Blue法檢測細(xì)胞的增殖情況，以確定材料的細(xì)胞毒性。觀察EPCs在水凝膠中的成管化狀態(tài)，以檢測細(xì)胞是否仍具有生理功能。結(jié)果三種濃度Matrigel中30%的Matrigel細(xì)胞毒性較大，而三種濃度的PuraMatrix中1%的PuraMatrix細(xì)胞毒性較大。EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面較混懸其中的細(xì)胞增殖率高，而且此差異隨Matrigel的濃度增高而增強。EPCs在20%和30%的Matrigel表面培養(yǎng)均能成管化，在10%的Matrigel表面和混懸其中培養(yǎng)7 d，多數(shù)細(xì)胞沉底。20%的Matrigel中培養(yǎng)7 d能夠立體成管化。而30%的Matrigel中，EPCs僅能伸出少數(shù)突起，不能成管化。PuraMatrix在0.25%和0.5%的濃度時，EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表面與細(xì)胞混懸其中的細(xì)胞增殖率相比無明顯差異；而在1%時EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表面和混懸其中存活率均很低。EPCs在0.25%和0.5%的PuraMatrix表面培養(yǎng)，細(xì)胞能夠穿入PuraMatrix中。而在0.25%的PuraMatrix中培養(yǎng)細(xì)胞可附著于材料上，但較難成管化，0.5%的PuraMatrix中培養(yǎng)7 d能夠成管化。三種細(xì)胞密度相比，107個/ml的細(xì)胞密度EPCs更容易體外成管化。結(jié)論Matrigel和PuraMatrix在適當(dāng)?shù)臐舛?20%Matrigel和0.5%PuraMatrix)均能與培養(yǎng)細(xì)胞良好的相容，并且起到支撐作用，模擬正常生理狀態(tài)，給細(xì)胞提供一個三維生長環(huán)境。由于PuraMatrix為人工合成肽產(chǎn)物，降解產(chǎn)物無毒性，可能是更適合移植的生物材料。

內(nèi)皮祖細(xì)胞； 水凝膠； 生物相容性

中樞神經(jīng)損傷后往往形成一個空腔，而神經(jīng)再生時需要細(xì)胞替代和分化，但空腔中沒有任何結(jié)構(gòu)可供細(xì)胞附著。因此，使用適當(dāng)?shù)纳锊牧辖Y(jié)合干細(xì)胞移植是潛在的治療中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的方式。理想的生物材料應(yīng)具有無生物毒性，可生物降解，為組織重建提供一個三維立體支架，孔徑可供組織重建時血管化，誘發(fā)最小的免疫反應(yīng)的特性[1]。已有應(yīng)用嚙齒動物干細(xì)胞結(jié)合生物材料支架應(yīng)用于細(xì)胞治療神經(jīng)創(chuàng)傷的動物實驗[2-4]。但尚沒有水凝膠材料的應(yīng)用實驗，水凝膠具有可被注入脊髓或腦損傷空腔，然后原地聚合，適應(yīng)損傷空腔形狀的優(yōu)點。本實驗檢測體外誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)與基質(zhì)膠(Matrigel)和自組裝蛋白肽水凝膠 (PuraMatrix)(均為美國BD公司產(chǎn)品)兩種水凝膠材料之間的相容性?；|(zhì)膠Matrigel是Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤細(xì)胞基底膜提取物。它的成分包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、內(nèi)功素、巢蛋白、肝素化硫酸鹽蛋白多糖以及一些生長因子[5]。低溫時為液態(tài)，但溫度升高至室溫即可形成凝膠[6]。GFR-Matrigel是無生長因子除TGF-beta 的Matrigel。自組裝蛋白肽水凝膠PuraMatrix是一種肽合成的水凝膠，是在酵母菌蛋白中發(fā)現(xiàn)的與EAK16重復(fù)串聯(lián)相似的離子自組裝寡肽。這是一個16-mer肽按照精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丙氨酸(RADARADARADARADA或RAD16)的序列重復(fù)構(gòu)成的，可容納超過99%含量的水。當(dāng)暴露于單價陽離子時β-sheet結(jié)構(gòu)自發(fā)的聚合起來而使水凝膠自溶解狀態(tài)凝膠化[7]。已經(jīng)有實驗證明這種凝膠可以支持細(xì)胞增殖和附著[7]。尚沒有實驗檢測這些水凝膠和脂肪來源EPCs的生物相容性，EPCs是一種具有自我增殖分化能力，并主要參與血管新生的細(xì)胞，適合用于細(xì)胞移植術(shù)的細(xì)胞來源。理想的生物材料應(yīng)具備的性質(zhì)之一就是孔徑可供組織重建時血管化，為此本實驗體外觀察EPCs在水凝膠中是否能夠成管化，為進(jìn)一步動物實驗做準(zhǔn)備。

材料和方法

一、實驗動物

大鼠的脂肪干細(xì)胞 (adipase derived stem cells，ADSCs)分離自近交系雄性Wistar大鼠(2月齡，體質(zhì)量220~280 g)腹股溝脂肪墊。具體分離培養(yǎng)ADSCs并進(jìn)一步誘導(dǎo)為骨髓源性EPCs和脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的方法詳見本實驗室前期工作[8]。

二、實驗試劑材料

本實驗選擇的基質(zhì)膠為去生長因子的Matrigel(Becton，Dickinson and Company.Bedford，MA，USA)，以期將非基質(zhì)膠對EPCs的影響降到最低。另一種水凝膠為PuraMatrix(Cambridge，MA，USA)。

三、實驗分組

本實驗分別設(shè)Matrigel表面組 (EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面)、Matrigel內(nèi)部組 (EPCs于Matrigel內(nèi)部立體培養(yǎng))、PuraMatrix表面組 (EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表 面)、PuraMatrix內(nèi) 部 組 (EPCs于PuraMatrix內(nèi)部立體培養(yǎng))和普通平面培養(yǎng)組，并根據(jù)不同檢測目的又按照使用水凝膠材料的濃度或培養(yǎng)細(xì)胞密度進(jìn)一步設(shè)立亞組。

四、實驗方法

1.不同濃度水凝膠材料對EPCs的alamarBlue分析:該檢測采用Matrigel表面組、Matrigel內(nèi)部組、PuraMatrix表面組和PuraMatrix內(nèi)部組作為實驗組，以普通平面培養(yǎng)組為正常對照組，Matrigel的濃度分別選擇10%、20%和30%，PuraMatrix的濃度分別選擇0.25%、0.5%和1%。培養(yǎng)物中EPCs的最終細(xì)胞密度為1×106個/ml，以alamarBlue(Invitrogen，Paisley，UK)方法檢測各濃度水凝膠對EPCs的細(xì)胞毒性，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)7 d時進(jìn)行細(xì)胞毒性(細(xì)胞增殖率)檢測。實驗于96孔板上進(jìn)行，每行為一組，每4列為同一個水凝膠濃度，即每個濃度、每組設(shè)4個孔。按照alamarBlue法的需要分別設(shè)單純培養(yǎng)基組、單純培養(yǎng)基＋alamarBlue組、EPCs平面培養(yǎng)＋alamarBlue組、EPCs加于 Matrigel表面＋alamarBlue組、EPCs加于PuraMatrix表 面 ＋alamarBlue組 、EPCs混 懸 于Matrigel中＋alamarBlue組和EPCs混懸于PuraMatrix中＋alamarBlue組，有水凝膠材料組的每孔50 μL水凝膠之上加50 μL培養(yǎng)基，無水凝膠組則直接加100 μL培養(yǎng)基。換液時一次換2/3或3/4量液體，避免損傷水凝膠的表面結(jié)構(gòu)。需培養(yǎng)7 d的4列先加樣，2 d后需培養(yǎng)5 d的4列加樣，依次類推，最后全部達(dá)到培養(yǎng)時間時，需加alamarBlue的組分別于每孔加入10 μL alamarBlue，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀在570 nm和630 nm兩個波長分別測量每孔的吸光率，并使用公式計算細(xì)胞毒性/細(xì)胞增殖率。具體公式如下:

其中A為吸光率，LW為短波長即570 nm，HW為長波長即630 nm，RO為矯正參數(shù)，計算公式如下:

RO=AOLW/AOHW

其中AO是單純培養(yǎng)基＋alamarBlue組的吸光率減去單純培養(yǎng)基組的吸光率的差值。整個實驗重復(fù)3次，以得出統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2.EPCs和不同濃度水凝膠材料不同培養(yǎng)方式細(xì)胞生長情況的形態(tài)學(xué)觀察:分別于培養(yǎng)1、3、5、7 d時用倒置顯微鏡觀察上述各組中培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)變化。其中由于PuraMatrix形成的水凝膠材料中可見透明條索狀物質(zhì)，與培養(yǎng)后期EPCs所形成的條索狀形態(tài)難于區(qū)分，故使用Hochest33342染色法對細(xì)胞進(jìn)行染色后觀察，或在細(xì)胞標(biāo)記了DII熒光染色劑后再行共培養(yǎng)，于熒光顯微鏡下觀察，配套Leica成像系統(tǒng)采集圖像，立體結(jié)構(gòu)采用連續(xù)多層同位拍照，使用Imagepro-Plus6.0(IPP6.0)軟件(USA)進(jìn)行多層合并，得到立體結(jié)構(gòu)的平面圖。

3.不同密度EPCs于最適濃度水凝膠材料中培養(yǎng)情況觀察:使用1×105個/ml、1×106個/ml和1× 107個/ml三個細(xì)胞密度于前述第4點中檢測出的最適濃度Matrigel和PuraMatrix中混懸培養(yǎng)，分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和alamarBlue細(xì)胞增殖的分析。具體方法同上。

4.NSCs于最適濃度水凝膠材料中培養(yǎng)的情況觀察。將大鼠ADSCs誘導(dǎo)分化的NSCs的神經(jīng)球接種于最適濃度Matrigel和PuraMatrix中培養(yǎng)，觀察其生長及分化情況，并做免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，具體方法及抗體見本實驗室前期工作[9]。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，alamarBlue的結(jié)果用兩因素析因設(shè)計方差分析方法進(jìn)行分析，進(jìn)一步的組間的多重比較采用最小顯著性差異法(least-significant difference，LSD)的方法，不同接種密度細(xì)胞的增殖能力的檢測數(shù)據(jù)用單因素方差分析方法，進(jìn)一步的組間的多重比較采用LSD的方法，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0軟件數(shù)據(jù)包處理，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、不同濃度水凝膠材料及不同培養(yǎng)方式對EPCs的alamarBlue分析

EPCs與三種濃度Matrigel共培養(yǎng)，Matrigel的細(xì)胞毒性隨濃度增高而增大，其中30%的Matrigel內(nèi)部培養(yǎng)細(xì)胞毒性最大，EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面較混懸其中的細(xì)胞增殖率高，而且此差異隨Matrigel的濃度增高而增強(表1)。本組數(shù)據(jù)中培養(yǎng)方式因素和Matrigel濃度因素的交互作用有顯著差異(F=7.933，P=0.006)，提示隨Matrigel濃度的增高，EPCs在其表面培養(yǎng)與在其內(nèi)部培養(yǎng)，對細(xì)胞的增殖的影響有顯著差異。EPCs與3種濃度PuraMatrix共培養(yǎng)，細(xì)胞毒性也有隨濃度增高而增大的趨勢，并且也出現(xiàn)了表面較內(nèi)部培養(yǎng)增殖率更高的現(xiàn)象 (表2)。而不同培養(yǎng)方式之間比較沒有顯著差異 (F= 0.448，P=0.516)，說明EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表面或內(nèi)部，對細(xì)胞的增殖沒有顯著影響。

二、不同濃度水凝膠材料及不同培養(yǎng)方式對EPCs的生長形態(tài)的影響

EPCs在10%的Matrigel的表面或內(nèi)部培養(yǎng)均會沉降至培養(yǎng)板底部，生長方式類似普通平面培養(yǎng)(圖1)。在20%和30%的Matrigel表面培養(yǎng)均能成管化，與常做的體外血管生成實驗的方法和結(jié)果類似。在20%和30%的Matrigel內(nèi)部培養(yǎng)，2 d以內(nèi)EPCs的形態(tài)類似圓形，分散懸于Matrigel中，20% 的Matrigel中培養(yǎng)7 d能夠立體成管化，而30%的Matrigel中，EPCs僅能伸出少數(shù)突起，不能成管化(圖2)。EPCs在0.25%和0.5%的PuraMatrix表面培養(yǎng)，細(xì)胞能夠穿入PuraMatrix中，形成在0.25%和0.5%的PuraMatrix內(nèi)部培養(yǎng)類似的效果，而在1% PuraMatrix表面培養(yǎng)的EPCs則很少穿入PuraMatrix中，僅在PuraMatrix表面鋪展生長。在0.25%的PuraMatrix內(nèi)部培養(yǎng)的細(xì)胞可附著于材料上，但較難成管化，0.5%的PuraMatrix內(nèi)部培養(yǎng)7 d能夠觀察到成管化現(xiàn)象(圖3)。

三、不同密度EPCs于最適濃度水凝膠材料中培養(yǎng)的情況觀察

根據(jù)AlamarBlue實驗的結(jié)果可知20%Matrigel 和0.5%PuraMatrix是最適合EPCs生長的濃度。因此在20%Matrigel和0.5%PuraMatrix內(nèi)部以1×105個/ml、1×106個/ml和1×107個/ml 3種細(xì)胞密度分別接種EPCs，觀察EPCs增殖情況發(fā)現(xiàn)1×105個/ml的增殖情況較差，而1×106個/ml和 1×107個/ml 2種密度比較無明顯差異(表3)。在20%Matrigel中EPCs以1×105個/ml、1×106個/ml和1×107個/ml 3種細(xì)胞密度接種均能夠形成條索狀結(jié)構(gòu)，其密度隨細(xì)胞接種密度增加而增加(圖4)。而在0.5%PuraMatrix 中EPCs以1×105個/ml細(xì)胞密度接種時，很難形成微管狀結(jié)構(gòu)，1×106個/ml中可以形成條索狀結(jié)構(gòu)，而1×107個/ml則很容易形成，管徑大小不同，并且互相交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖5)。

表1 Matrigel的細(xì)胞毒性(x±s，n=3)

表2 PuraMatrix的細(xì)胞毒性(x±s，n=3)

表3 20%Matrigel和0.5%PuraMatrix中的不同密度細(xì)胞的增殖情況(x±s，n=3)

圖1 10%Matrigel中EPCs沉于底部，平面生長(×200)

四、NSCs于最適濃度水凝膠材料中培養(yǎng)的情況觀察

NSCs的神經(jīng)球直接接種于 20%Matrigel和0.5%PuraMatrix中，觀察發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球中的細(xì)胞會逐漸向球外遷移，并開始長出具有分支的細(xì)胞。對培養(yǎng)10 d的NSCs進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球局部仍有較多Nestin陽性細(xì)胞，但遷移出來的細(xì)胞具有多個較長突起的往往表達(dá)GFAP陽性，且其細(xì)胞核往往肥大，具有細(xì)長突起的細(xì)胞胞體被Neun染色，0.5%PuraMatrix中NSCs分化得更快，并且分化獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞更多(圖6)。

討論

生物工程是20世紀(jì)70年代初開始興起的一門新興的綜合性應(yīng)用學(xué)科，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用主要是以生物學(xué)的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代工程技術(shù)，以生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物或發(fā)揮它們獨特生理功能的一門新興技術(shù)。在創(chuàng)傷修復(fù)方面則主要以合適的干細(xì)胞結(jié)合生物組織工程材料共移植的方式。在神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)中早期有關(guān)于嚙齒類動物的干/祖細(xì)胞與聚乙交酯PGA和聚丙交酯PLA以及它們的聚合物聚乳酸-羥基乙酸共聚物 [poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]相容性的文章[4,10-12]，但是由于PLGA是一種硬材料，使用其作為中樞神經(jīng)損傷的移植材料，需將其填塞入損傷空腔，會造成2次損傷，不是理想的材料。一種理想的中樞神經(jīng)組織修復(fù)的生物材料應(yīng)該具有能夠與干細(xì)胞混合并可注射入損傷空腔中的液體形態(tài)，一旦移植入體內(nèi)則很快凝固，并構(gòu)成三維支架供細(xì)胞攀附的特性。Matrigel和PuraMatrix是兩款細(xì)胞相容性較好的水凝膠，近期已經(jīng)有將它們的生物相容性與其他常用生物細(xì)胞支架相比較的文獻(xiàn)[13,14]，研究結(jié)果表明盡管細(xì)胞的存活率和分化能力有些許不同，但水凝膠材料和其他支架性材料具有可比性。

圖2 Matrigel中細(xì)胞生長情況

圖3 EPCs與PuraMatrix共培養(yǎng)情況

圖4 EPCs以1×107個/ml密度接種于20%Matrigel中形成的網(wǎng)格狀微管系統(tǒng)

圖5 EPCs以1×107個/ml密度接種于0.5%PuraMatrix中形成的網(wǎng)格狀微管系統(tǒng)

圖6 光鏡下觀察NSCs在水凝膠中培養(yǎng)有細(xì)胞遷移出神經(jīng)球，并且細(xì)胞形態(tài)有改變，細(xì)胞伸出突起

在本次實驗中EPCs與三種濃度Matrigel共培養(yǎng)，Matrigel的細(xì)胞毒性隨濃度增高而增大，其中30%的Matrigel內(nèi)部培養(yǎng)細(xì)胞毒性最大，EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面較混懸其中的細(xì)胞增殖率高，而且此差異隨Matrigel的濃度增高而增強。這個結(jié)果與Thonhoff等[9]的實驗結(jié)果不完全相符，其原因可能是Thonhoff等[9]使用的Matrigel是含生長因子的，所以在其濃度增加時，雖然材料本身的細(xì)胞毒性增加，但生長因子的濃度也增加，所以在1%~10%濃度時細(xì)胞增殖率/存活率下降，但當(dāng)濃度增加至50%時，細(xì)胞的增殖率/存活率反而上升。而本實驗所采用的Matrigel為去除生長因子的，所以可以客觀的反應(yīng)出細(xì)胞毒性隨材料濃度增加而增加的趨勢。EPCs與三種濃度PuraMatrix共培養(yǎng)，細(xì)胞毒性也有隨濃度增高而增大的趨勢，并且也出現(xiàn)了表面較內(nèi)部培養(yǎng)增殖率更高的現(xiàn)象。而三種濃度的PuraMatrix中1%的PuraMatrix細(xì)胞毒性較大。這與目前多數(shù)實驗結(jié)果相符[13,14]。這種細(xì)胞毒性反應(yīng)可能是因為材料降解所釋放的毒性或酸性產(chǎn)物造成的。

理想的水凝膠材料除了應(yīng)具有低生物毒性外，還應(yīng)具有不干擾移植細(xì)胞的正常生理功能的性質(zhì)。實驗中EPCs在水凝膠中能夠成管化，這與早期的一些實驗結(jié)果一致[15-19]。在本實驗中EPCs在10%的Matrigel的表面或內(nèi)部培養(yǎng)均會沉降至培養(yǎng)板底部，生長方式類似普通平面培養(yǎng)，說明10%的Matrigel孔徑過大，或粘稠度不足以使EPCs抵抗重力影響，所以雖然其細(xì)胞毒性最小，但不適于用于生物工程組織修復(fù)。而EPCs在20%和30%的Matrigel表面培養(yǎng)均能成管化，與常做的體外血管生成實驗的方法和結(jié)果類似，說明20%和30%的Matrigel的結(jié)構(gòu)較難使EPCs遷入。EPCs在20%和30%的Matrigel內(nèi)部培養(yǎng)，2 d以內(nèi)EPCs的形態(tài)類似圓形，分散懸于Matrigel中，20%的Matrigel中培養(yǎng)7 d能夠立體成管化，而30%的Matrigel中，EPCs僅能伸出少數(shù)突起，不能成管化，說明20%的Matrigel的密度較適合EPCs在其內(nèi)部成管化，而30%的Matrigel則密度過大。EPCs在0.25%和0.5% 的PuraMatrix表面培養(yǎng)，細(xì)胞能夠穿入PuraMatrix中，形成在0.25%和0.5%的PuraMatrix內(nèi)部培養(yǎng)類似的效果，而在1%PuraMatrix表面培養(yǎng)的EPCs則很少穿入PuraMatrix中，僅在PuraMatrix表面鋪展生長。在0.25%的PuraMatrix內(nèi)部培養(yǎng)的細(xì)胞可附著于材料上，但較難成管化，0.5%的PuraMatrix內(nèi)部培養(yǎng)7 d能夠觀察到成管化現(xiàn)象，分析其原因可能是0.25%的PuraMatrix形成的支架網(wǎng)格孔徑過大，細(xì)胞之間較難形成聯(lián)系，而0.5%的PuraMatrix的孔徑較合適。這與Narmoneva等[13]的研究結(jié)果不完全符合，在他們的研究中使用了自組裝短肽水凝膠與大鼠脂肪組織來源的微血管ECs進(jìn)行體外血管新生的生物工程研究，他們認(rèn)為1%的自組裝短肽水凝膠為合適的濃度，而本次實驗中為0.5%的PuraMatrix，這可能是因為筆者采用PuraMatrix中氨基酸組成成分與他們所使用的短肽不同。另外成管化的時間也不同，他們的實驗中16 h即可成管化，而本次的實驗中2 d以內(nèi)都沒有明顯的成管化現(xiàn)象，分析其原因可能是EPCs需要先分化為成熟的ECs再成管化。

理想的水凝膠材料應(yīng)具備的另一個屬性即不妨礙移植細(xì)胞的正常分化能力。本實驗中NSCs在Matrigel中分化時，星形膠質(zhì)細(xì)胞較多，而神經(jīng)元較少，這與Thonhoff等[9]的實驗結(jié)果類似，對于這一點他們的分析是認(rèn)為Matrigel對神經(jīng)元毒性較大所致，而筆者認(rèn)為除此之外還有可能是因為Matrigel的微環(huán)境更利于NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞的方向分化，因為在用同源性的EPCs做細(xì)胞毒性實驗時，20%Matrigel與0.5%PuraMatrix的細(xì)胞增殖率的數(shù)據(jù)類似，說明并不一定是因為細(xì)胞毒性的問題。另外本實驗中觀察到在Matrigel中分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核都較肥大，Albrecht等[20]的研究認(rèn)為活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有肥大的細(xì)胞核，所以推測在Matrigel中分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞均處于被活化的狀態(tài)。由于Matrigel的成分復(fù)雜，所以尚不知是其中的一個還是數(shù)個成分導(dǎo)致這樣的細(xì)胞形態(tài)改變。本次實驗的結(jié)果與Flanagan等[21]和Katakowski等[22]的結(jié)果不同，可能是因為筆者采用的Matrigel濃度與他們不同，且采用的Matrigel不含生長因子成分。盡管檢測神經(jīng)系的三種重要細(xì)胞標(biāo)記物是必要的，但在體外很少能夠在NSCs分化后2~3周以內(nèi)檢測到少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物O4，但由于水凝膠材料的降解及體外培養(yǎng)時每次換液都有可能造成的材料損失或稀釋，導(dǎo)致在體外觀察時間不夠長，本實驗在體外分化10 d，已經(jīng)是目前已有研究中較長的，尚不足以觀察和檢測少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物。體外誘導(dǎo)分化用于移植的神經(jīng)元通常將NSCs培養(yǎng)于多聚賴氨酸和層粘連蛋白包被的培養(yǎng)板上，將獲取的神經(jīng)元嫁接入神經(jīng)元缺損區(qū)域的策略[19]。而將NSCs植入水凝膠中則模擬了體內(nèi)模型，但在這個實驗中進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色時，細(xì)胞損失非常大，無法進(jìn)行嚴(yán)格的細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計。而且本實驗將神經(jīng)球置于水凝膠材料內(nèi)部培養(yǎng)，模擬了正常生物組織中細(xì)胞處于細(xì)胞基質(zhì)和各種支架之間的生理狀態(tài)，較早期的將神經(jīng)干/祖細(xì)胞置于Matrigel表面培養(yǎng)觀察其遷移和分化的研究更有意義[20,21,23]。

因為PuraMatrix能夠在相當(dāng)較低的濃度凝膠化，并且對細(xì)胞毒性相對較小，所以本實驗中神經(jīng)球在PuraMatrix中表現(xiàn)出細(xì)胞遷移和接近正常比例的膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元分化能力似乎是理所應(yīng)當(dāng)。盡管在體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞遷移的距離較正常培養(yǎng)方式的神經(jīng)球近，可能是因為PuraMatrix凝膠化后形成的纖維有一定的阻隔作用，但有理由相信在移植入體內(nèi)后，由于PuraMatrix的纖維網(wǎng)絡(luò)提供了供細(xì)胞攀附和遷移的三維支架，能夠促進(jìn)神經(jīng)組織缺失的修補。

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Compatibility of rodent epithelial progenitor cells with biomaterial hydrogels in vitro

Xue Shan1, Wu Gang2,Luo Shiyu3,Zhang Peng4,Zhang Hongtian4,Fa Zhiqiang1,Guo Yanwu1,Ke Yiquan1,Xu Ruxiang4.1Department of Neurosurgery,Neurosurgery Institute,Key Laboratory on Brain Function Repair and Regeneration of Guangdong Province,Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282,China;2Department of Oncology,Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282,China;3Second Clinical College of Southern Medical University,Guangzhou 510282, China;4The Affiliated Bayi Brain Hospital,The Military General Hospital of Beijing PLA,Beijing 100700,China

Xu Ruxiang,Email:zjxuruxiang@163.com

ObjectiveTo test the interaction of in vitro cultured cells and biological engineering hydrogel materials,providing theoretical basis for the treatment strategy of in vitro culturedcells and biological engin eering hydrogel transplantation.MethodsTwo different components hydrogel Matrigel and PuraMatrix were used as experimental material,and EPCs derived as previous method used as detecting cells.At different concentrations of Matrigel(10%,20%,30%)or PuraMatrix (1%,0.5%,0.25%),EPCs were cultivated on surface or within the hydrogels.Observe the morphology and detect cell proliferation by Alamar Blue method in different time to determine the cytotoxicity of hydrogel materials.Observe the in vitro angiogenesis ability of EPCs to detect whether cells still have physiological function.Resultsthree concentrations of Matrigel,30%Matrigel is highest cytotoxicity. Among three PuraMatrix concentration,1%PuraMatrix is highest cytotoxicity.The cell proliferation rate of EPCs training on surface of Matrigel is high than suspension in Matrigel,and the difference between these two training mode enhanced while the concentration of Matrigel increased.The in vitro angiogenesis ability of EPCs was observed on 20%and 30%Matrigel surface.EPCs descended to the bottom when cultured in or on surface of 10%Matrigel 7 days.The in vitro angiogenesis ability of EPCs was observed in 20%Matrigel,but in 30%Matrigel,EPCs only stretch minority pustute.The cell proliferation rates were no significant differences when EPCs training on surface of or in 0.25%and 0.5%PuraMatrix.But when EPCs training on surface of or in 1%PuraMatrix,the survival rate of cell is very low.EPCs can migrat in 0.25%and 0.5%PuraMatrix when cultured on surface.But in 0.25% PuraMatrix,EPCs attached to the material,but had difficult to perform in vitro angiogenesis.The in vitro angiogenesis ability of EPCs was observed in 0.5%PuraMatrix.Among three densitys of EPCs,density of 107cell/ml in vitro angiogenesis are more easily.In the hydrogel.ConclusionMatrigel and PuraMatrix in the appropriate concentration (20%)and 0.5%have good compatibility with EPCs and NSCs,and can serve as support,imitate physiological condition,to provide a three-dimensional cell growth environment,non-toxic degradation products,may be more suitable for transplantation treatment.

Endothelial progenitor cells; Hydrogel;Biocompatibility

2015-07-10)

(本文編輯:張麗)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.06.008

國家自然科學(xué)基金(u0632008、30801184、30772232、30500526、81501046)廣東省自然科學(xué)基金(S2011040003565)

510282廣州，南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科，神經(jīng)外科研究所1；廣東省腦功能修復(fù)和再生重點實驗室南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腫瘤中心2；南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院3；100700北京，北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院4

徐如祥，Email:zjxuruxiang@163.com

薛杉,吳鋼,羅詩雨,等.嚙齒動物上皮祖細(xì)胞與生物材料水凝膠生物相容性的體外研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(6)：346-353.