芝麻醬中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定

摘要：建立了高效液相色譜法同時測定芝麻醬中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法。樣品用甲醇+水（70+30，V/V）超聲提取，免疫親和柱凈化富集，光化學柱后衍生，高效液相色譜熒光法對芝麻醬中黃曲霉毒素含量進行測定，以保留時間定性，峰面積外標法定量。結果表明，樣品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限分別為0.5、0.2、0.7、0.2μg/kg，線性相關系數(shù)>0.999，三個添加水平的回收率均在87.2%～99.4%之間，相對標準偏差為2.88%～5.23%。

關鍵詞：高效液相色譜；黃曲霉毒素；芝麻醬

中圖分類號：TB

文獻標識碼：A

文章編號：16723198（2015）22022902

黃曲霉毒素是生長在食物及飼料中的黃曲霉和寄生曲霉代謝的一組化學結構類似的產物，黃曲霉毒素主要有四種：B1、B2、G1、G2，其中B1被認為是主要的有毒物質，M1和M2是這種毒素的代謝產物。黃曲霉毒素是一種強致癌物質，能使人體的免疫功能喪失，誘導畸形、癌癥的發(fā)生。許多國家已規(guī)定其相應的膳食攝入量和食品的限量標準。按照GB 2761-2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》要求，在花生油、花生及其制品中黃曲霉毒素B1的允許最大含量水平為20μg/kg。目前市場上的芝麻醬，大都摻雜了很大比例的花生醬，由于花生容易發(fā)霉變質，將花生醬摻入芝麻醬中容易引起芝麻醬中黃曲霉毒素超標，因此開展芝麻醬中黃曲霉毒素的檢測，對保障我國人民身體健康有重要意義。

目前，對黃曲霉毒素的測定方法主要有高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法。酶聯(lián)免疫法操作簡單，但特異性差；高效液相色譜法結合柱前衍生或普通的碘柱后衍生的方法，操作繁瑣，分析時間長，并產生大量的有毒有害物質，不能滿足批量檢測的需求。

近年來用免疫親和柱凈化光化學柱后衍生-高效液相色譜法測定黃曲霉毒素含量已有一些報道，但芝麻醬中黃曲霉毒素含量測定方法尚未見報道。本文通過免疫親和柱凈化，光化學柱后衍生，高效液相色譜法同時測定芝麻醬中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量，取得滿意結果。

1材料與方法

1.1材料與儀器

甲醇（色譜純）購自Sigma公司；黃曲霉毒素混合標準溶液B1、B2、G1、G2購自SUPLCO公司；3mL黃曲霉毒素免疫親和柱購自中檢維康公司。

Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀，配熒光檢測器和光化學柱后衍生器；DIONEX Acclaim 120 （4.6×250mm，5μm）色譜柱；PRIMA PM3-900TL型超聲波；美國Millipore公司超純水處理器；Scientific industries vortex Genie 2渦旋振蕩器；Agilent20管固相萃取SPE裝置；奧特賽恩斯AP-9925無油真空泵。

1.2實驗方法

1.2.1黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準溶液的配制

（1）黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準儲備液的配制。

準確移取1.0mL黃曲霉毒素混合標準溶液于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

（2）黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準使用液的配制。

準確移取1.0mL黃曲霉毒素標準儲備液于10mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度。

1.2.2色譜條件

色譜柱：C18（4.6×250mm，5μm），柱溫：30℃，流動相為甲醇：水=45∶55（V∶V）；流速：1mL/min；進樣量：10μL；激發(fā)波長：360nm；發(fā)射波長420nm。

1.2.3樣品提取

稱取均勻試樣5g（精確至0.001g）于50mL離心管中，加入1.0g氯化鈉、25mL甲醇+水（V∶V，70∶30），渦旋混勻，超聲提取20min，渦旋混勻，8000r/min離心10min，取上清液用折疊式槽紋濾紙過濾，收集濾液5mL，用10mL超純水稀釋，供凈化用。

1.2.4樣品凈化

將免疫親和柱連接于10mL注射器下，待免疫親和柱內的液體棄去1/3后，將上述稀釋后的濾液全部注入注射器中，樣品溶液在重力下過柱，待樣品提取液滴完后，向注射器內加入10mL水淋洗免疫親和柱，直至2～3mL空氣通過柱體，用真空泵抽干，向免疫親和柱內準確加入1.0mL甲醇洗脫，用真空泵抽干，收集全部洗脫液，過0.45μm濾膜，供高效液相色譜用。

2結果與討論

2.1提取條件的選擇

實驗中采用甲醇-水（V∶V，6∶4）、甲醇-水（V∶V，7∶3）、甲醇-水（V∶V，8∶2）為提取劑，按照上述方法處理樣品，加標量按質量濃度為10μg/kg添加，每個濃度的提取液平行測定三次，比較它們的提取效果。結果表明，甲醇-水（V∶V，6∶4）提取液，由于有機溶劑所占比例較低，提取效率較低；甲醇-水（V∶V，8∶2）提取液，甲醇濃度過高，破壞免疫親和柱的抗體，回收率較低；甲醇-水（V∶V，7∶3）的提取效果較好，可以滿足全部組分對回收率的要求（見表1）。

2.2衍生方式選擇

對三氟乙酸柱前衍生法、柱后碘溶液衍生和光化學在線柱后衍生法進行了考察。三氟乙酸柱前衍生法受衍生試劑用量、衍生反應溫度、衍生時間、溶劑轉換等因素影響，衍生結果重現(xiàn)性較差，回收率在75.8%～115.5%之間，且需要用到大量有毒有害試劑；柱后碘衍生法和光化學柱后衍生法均能獲得較好的重現(xiàn)性，回收率均在86.8%～99.5%之間，但柱后碘衍生法需要配制碘溶液，儀器操作繁瑣；光化學衍生法在儀器操作上相對簡單，樣品處理后可直接進樣分析，故本實驗選擇光化學在線柱后衍生法。經過光化學柱后衍生的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準溶液色譜圖見圖1。

2.3線性范圍及檢出限

配制一系列質量濃度的黃曲霉毒素混合標準工作溶液，在優(yōu)化的實驗條件下分別進行測定，以峰面積Y（counts）對其濃度X（μg/L）進行線性回歸；在陰性樣品中依次加入較低濃度的標準溶液后進行測定，以3倍基線噪聲（S/N=3）所對應的濃度計算方法的檢出限，結果見表2。

2.4方法回收率和精密度實驗

選擇一個空白芝麻醬，分別加入低、中、高三種不同濃度的黃曲霉毒素，平行測定三次，回收率和相對標準偏差見表3。

2.5實際樣品的測定

按照1.2實驗方法對飲食店中隨機采集的50份芝麻醬樣品中黃曲霉毒素的含量進行分析，其中11份樣品中檢出黃曲霉毒素，總量分布在1～200μg/kg之間，色譜圖見圖2。

3結論

本方法建立的免疫親和柱凈化光化學柱后衍生-高效液相色譜法同時測定芝麻醬中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能夠對芝麻醬樣品中黃曲霉毒素含量進行批量、準確、快速的檢測。

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