Slit2和SrGAP2與難治性癲癇的相關(guān)研究

摘要：Slits家族及Slit-Robo下游信號通路中RhoGAP分子SrGAPs家族在神經(jīng)元軸突導向和突觸生長中有著重要作用，且與難治性癲癇的發(fā)生密切相關(guān)。作為家族中的重要成員，Slit2和SrGAP2在難治性癲癇中發(fā)揮重要的作用，對其研究也很廣泛，本文就Slit2和SrGAP2與難治性癲癇的相關(guān)研究進行綜述。

關(guān)鍵詞：Slit2；SrGAP2；難治性癲癇；苔蘚纖維出芽

癲癇（epilepsy）是由于大腦神經(jīng)元反復發(fā)作的異常放電而引起的、以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病，其中約70%～80%的患者經(jīng)系統(tǒng)抗癲癇藥治療獲得長期緩解，甚至治愈，但約20%～30%發(fā)作不能得到有效控制，稱之難治性癲癇（refractory epilepsy，RE），現(xiàn)階段，關(guān)于其發(fā)病機制的研究主要聚焦在神經(jīng)元突觸可塑性（synaptic plasticity）和苔蘚纖維出芽（mossy fiber sprouting，MFS）兩方面，它們均使神經(jīng)網(wǎng)絡發(fā)生了重組，是難治性癲癇的病理特征。Slit2和SrGAP2與MFS的發(fā)生緊密相關(guān)，本文就近幾年的國內(nèi)外相關(guān)研究展開綜述。

1 Slit2概述

1.1 Slits家族及功能 Slit基因最早是Nüsslein-Volhard等1984年在篩選影響黑腹果蠅幼蟲表皮型式發(fā)生的基因中發(fā)現(xiàn)的。在1988年由Tesser-Lavigne等在進行的體外培養(yǎng)試驗時發(fā)現(xiàn)底板能產(chǎn)生一種有吸引作用的化學因子，這些因子促使連合神經(jīng)元軸突向底板靶組織方向生長，而后又經(jīng)Kidd、Brose等人的研究實驗最終發(fā)現(xiàn)了Slits家族及其受體Roundabouts（Robos），它們同屬于分泌型蛋白，相對分子質(zhì)量約20萬，包括N-端的短信號肽（ss）、富含亮氨酸的重復序列（leucine-rich repeat，LRR）、6-9個表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣序列，一個ALPS （Agrin-Laminin-Perlecan-Slit）區(qū)域和C-端的富含半胱氨酸區(qū)域（cysteine knot），人鼠均有，同源性在60%以上。Slits家族有3種亞型：Slit1、Slit2和Slit3，這三種亞型在中樞、周圍神經(jīng)系統(tǒng)均有大量表達，此外，Slit3在一些發(fā)育的組織器官中也有表達[1]。

神經(jīng)軸突導向因子Slits及Robos是一種進化上高度保守的分泌型糖蛋白，在神經(jīng)軸突導向、神經(jīng)細胞遷移、神經(jīng)細胞形態(tài)分化等多種生命活動有重要的調(diào)節(jié)作用。Slits的功能主要通過LRR-2（leucine-rich repeat2）結(jié)構(gòu)域與Robos結(jié)構(gòu)域結(jié)合實現(xiàn)。

雙側(cè)對稱的生物，中線是發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)的重要中介部位，是動物傳遞左右兩側(cè)信息以及協(xié)調(diào)運動和整合感覺輸入的基礎，大多數(shù)的軸突投射到對側(cè)前要越過中線，然而這些軸突并不是毫無秩序、混亂或者反復穿越中線，中線穿越的過程離不開Slits的精細調(diào)控[2]。Slit基因敲除后，許多軸突連接不能離開中線，甚至有些軸突連接反復跨越中線[3]。在對小鼠視網(wǎng)膜軸突發(fā)育的研究實驗、雞和小鼠胚胎腦干縱向軸突發(fā)育實驗以及人類胚胎干細胞多巴胺能神經(jīng)軸突培養(yǎng)的體外實驗均證實Slits對神經(jīng)元軸突有排斥作用，Slits作為排斥性因子，保證了神經(jīng)元軸突只跨越中線一次，準確無誤到達既定位置，阻止軸突反復跨越中線形成異常的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。

大量實驗證實，哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)中，多數(shù)神經(jīng)元需要經(jīng)過遷移后到達發(fā)揮功能的部位發(fā)揮作用，遷移是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵過程之一，若不能正常進行，則會導致多個疾病的發(fā)生，一部分癲癇的發(fā)生就是如此。在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中，早期神經(jīng)嵴細胞的遷移，Slits家族是必須的神經(jīng)導向因子，能夠保證其正常分化及遷移，且進一步表明Slit因子是阻止神經(jīng)細胞嵴遷移的起始，能夠減弱其遷移速率[4]，在成熟大腦中，Slits參與損傷后的再生，Wang Y等人發(fā)現(xiàn)其調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元軸突的延長和分支，介導其遷移[5]。

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，神經(jīng)軸突和樹突有的從一個共同神經(jīng)突形成兩個子分支，有的從一個主軸長出多數(shù)側(cè)突，有的常在神經(jīng)末梢存在成百上千個分支，眾多的體外實驗證實，Slit1促進小鼠皮層神經(jīng)元軸突的延長和成年大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元再生神經(jīng)軸突的生長；異常的Slit2能夠增加處于伸長期的鼠腦干中央三叉神經(jīng)感覺神經(jīng)元軸突的分支，以上說明：Slit能夠促進神經(jīng)樹突的生長和分化。

除此之外，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生長、免疫細胞趨化、脈管系統(tǒng)生成、血管內(nèi)皮細胞生長等方面的研究，Slit/Robo信號通路也是近年來的熱點。

1.2 Slit2與難治性癲癇 正常人中，Slit2主要在神經(jīng)元中表達，而在癲癇患者中，其在星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中均表達，并且比其在正常組織中明顯高表達。Fang[3]等實驗發(fā)現(xiàn)，在難治性癲癇動物模型中1d～2w，Slit2的表達持續(xù)減低，認為這不是癲癇發(fā)生的原因，而是對神經(jīng)元癇性放電的一種適應性變化，也提示下調(diào)Slit2后可能會促進MFS，干擾神經(jīng)的正常連接，在難治性癲癇的發(fā)病機制中有所參與。Fothergill[6]等證實Slit2可抑制軸突的形成。

上述表明，Slit2失調(diào)會抑制正常連接的形成且會促進異常連接，還可能參與星形膠質(zhì)細胞增生及膠質(zhì)疤痕的形成，膠質(zhì)瘢痕正是藥物難進入大腦除血腦屏障（Blood Brain Barrier，BBB）之外的又一屏障，Slit2的上調(diào)可能抑制MFS的形成以及減少膠質(zhì)瘢痕的形成，這可能成為抗癲癇藥物作用的一個新靶點。

2 SrGAP2概述

2.1 SrGAPs家族及功能 SrGAPs（Slit-Robo GTPase-activating proteins）是Wong等在2001年利用酵母雙雜交系統(tǒng)實驗時發(fā)現(xiàn)的一種Slit-Robo下游信號RhoGAP分子并命名為SrGAPs家族。SrGAPs家族包括SrGAP1、SrGAP2、SrGAP3和ARHGAP4，目前多研究與人類相關(guān)的前三個因子，它們在結(jié)構(gòu)上具有很高的同源性。Aspenstrom P指出SrGAPs分子具有多個結(jié)構(gòu)域，其一級結(jié)構(gòu)具有較高一致性，包括1個F-BAR（FCH-Bin/Amphiphysin/Rvs）結(jié)構(gòu)域，其由1個FCH（Fer/Fes CIP4 homology）結(jié)構(gòu)域和相鄰2個CC（Coiled-coil）結(jié)構(gòu)域組成，1個RhoGAP（Rho GTPase-activating protein）結(jié)構(gòu)域和1個SH3（Src homology 3）結(jié)構(gòu)域。

SrGAPs家族不僅在結(jié)構(gòu)上高同源，且在功能上也頗多相似，研究表明：F-BAR介導細胞膜形態(tài)的改變，RhoGAP特異性水解RhoGTPase，SH3介導蛋白與蛋白間相互作用，這三個結(jié)構(gòu)域共同協(xié)調(diào)調(diào)控SrGAP分子的功能。SrGAP分子的功能主要依賴F-BAR所誘導絲狀偽足（filopodia）的活性，三種F-BAR在功能上有區(qū)別的，例如，在COS7細胞中，三種F-BAR可以誘導絲狀偽足的形成[7]，但是它們在皮層神經(jīng)元中功能卻不盡相同，SrGAP1可阻止絲狀偽足的形成，在分子水平上，COS7細胞中三種分子可以形成異源二聚體協(xié)同誘導絲狀偽足[8]。另外在細胞模上SrGAP2的F-BAR有很強的誘導絲狀偽足能力。SrGAP1在線蟲胚胎形成過程中通過F-BAR介導細胞間的粘附作用[9]；SrGAP2的F-BAR可以促進樹突棘的成熟及影響棘密度[10]、能誘導神經(jīng)元突起的生長和遷移；SrGAP3在促進樹突棘發(fā)育的起始時需要依賴F-BAR?？傊?，SrGAPs家族在神經(jīng)元軸突導向、神經(jīng)元遷移、突起生長和樹突形成起著重要作用。

2.2 SrGAP2與難治性癲癇 SrGAP2是Guerrier等學者在2009年實驗中發(fā)現(xiàn)的，并提出其在神經(jīng)元遷移、突觸生長方面有重要作用，SrGAP2定位細胞外周的軸突，通過F-BAR能夠顯著誘導絲狀偽足的形成，進一步影響到突起的分支及神經(jīng)元遷移；還通過SH3參與到F-BAR介導的絲狀偽足的形成過程；體外對SrGAP的探究顯示傾向于通過RhoGAP水解Rac1抑制神經(jīng)元突起的生長、影響細胞的遷移；體外培養(yǎng)SrGAP2過表達可以誘導與突觸分支關(guān)系密切絲狀偽足的形成；體外培養(yǎng)同時證實敲除SrGAP2后，軸突及樹突的分支數(shù)明顯下降。以上實驗提示SrGAP2能夠促進絲狀偽足的生成，而偽足的形成與MFS類似。

通過對難治性癲癇患者和正常人顳葉腦組織的標本檢測SrGAP2的表達情況，認為SrGAP2可能通過促進軸突生長和出芽參與MFS，進一步加重異常神經(jīng)網(wǎng)絡的建立，導致癲癇反復的自發(fā)性發(fā)作，最終形成難治性癲癇[11]。劉錦等人發(fā)現(xiàn)：SrGAP2在難治性癲癇動物組中的表達含量逐漸升高，且在2w左右達高峰并維持，到2個月左右降至接近對照組水平，提示其可能在難治性癲癇的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。另一項臨床研究中，一位患者染色體轉(zhuǎn)位造成的SrGAP2基因斷裂可能與早期嬰兒型癲癇性腦病的發(fā)生及精神運動性障礙有關(guān)[12]，SrGAP2基因敲除的小鼠也表現(xiàn)出了癲癇病癥狀[10]，但是造成這些癥狀的具體機制尚待更進一步的研究。

上述同樣表明，SrGAP2在難治性癲癇發(fā)生中有所參與，調(diào)節(jié)SrGAP2的表達可能在治療疾病中有所幫助。

3 小結(jié)

癲癇的腦組織神經(jīng)元由于長期反復的癇性放電發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生、神經(jīng)元喪失及凋亡、突觸功能增強、MFS等病理改變，其中，MFS、Slit2和SrGAP2在此發(fā)揮了重要的作用，但對它們在人體中的實驗仍需進一步研究，干預MFS可使難治性癲癇的治療更加容易。在以后的研究中，Slit2和SrGAP2將成為新的治療靶點，也將為癲癇的研究及防治提供新方向。

參考文獻：

[1]邵一葉，陳英輝.神經(jīng)導向因子調(diào)節(jié)海馬苔蘚狀纖維出芽及其與顳葉癲癇相關(guān)性[J].神經(jīng)解剖學雜志，2014，30（4）：499-502.

[2]于奇，周啟升，趙曉，等.神經(jīng)軸突導向分子Slit的功能及其分子作用機制研究進展[J].生理學報，2012，64（2）：220-230.

[3]Fang M，Liu GW，Pan YM，et al.Abnormal expression and spatiotemporal change of Slit2 in neurons and astrocytes in temporal lobe epileptic foci：A study of epileptic patients and experimental animals[J].Brain Res，2010，1324：14-23.

[4]Giovannone D，Reyes M，Reyes R，et al.Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor[J].Dev Dyn，2012， 241（1）：1274-1288.

[5]Wang Y，Teng HL，Huang ZH.Repulsive migration of Schwann cells induced by Slit-2 through Ca2+-dependent RhoA-myosin signaling[J].Glia，2013，61（5）： 710-723.

[6]Fothergill T，Donahoo AL，Douglass A，et al.Netrin-DCC Signaling Regulates Corpus Callosum Formation Through Attraction of Pioneering Axons and by Modulating Slit2-Mediated Repulsion[J].Cereb Cortex，2014，24（5）：1138-1151.

[7]Carlson，BR，Lloyd，KE，Kruszewski，A，et al.WRP/srGAP3 facilitates the initiation of spine development by an inverse F-BAR domain， and its loss impairs long-term memory[J].J Neurosci，2011，31（7）：2447-2460.

[8]Coutinho-Budd J，Ghukasyan V，Zylka MJ，et al.The F-BAR domains from srGAP1，srGAP2，and srGAP3 regulate membrane deformation differently[J].J Cell Sci，2012，125（14）：3390-3401.

[9]Zaidel-Bar R，Joyce MJ，Lynch AM，et al.The F-BAR domain of SRGP-1 facilitates cell-cell adhesion during C.elegans morphogenesis[J].J Cell Biol，2010，191 （4）：761-769.

[10]Charrier C，Joshi K，Coutinho-Budd J，et al.Inhibition of SRGAP2 Function by Its Human-Specific Paralogs Induces Neoteny during Spine Maturation[J].Cell，2012，149（4）：923-935.

[11]龐愛蘭，王雪峰，孟步亮，等.難治性癲癇患者腦組織中srGAP2的表達[J].神經(jīng)解剖學雜志，2014，30（3）：367-371.

[12]Saitsu H，Osaka H，Sugiyama S，et al.Early infantile epileptic encephalopathy associated with the disrupted gene encoding Slit-Robo Rho GTPase activating protein 2 （SRGAP2）[J].Am J Med Genet A，2012，158A（1）：199-205.

編輯/蔡睿琳