COPD患者外周骨骼肌萎縮中的功能性蛋白組學(xué)的研究

摘要：目的 對正常老年人、COPD患者無外周骨骼肌萎縮、COPD患者合并外周骨骼肌萎縮的蛋白電泳圖譜進(jìn)行配對分析比較，尋找差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。方法 應(yīng)用質(zhì)譜鑒定技術(shù)，對差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定。結(jié)論 經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)檢索，分析所鑒定的蛋白質(zhì)在COPD患者外周骨骼肌萎縮的關(guān)系，為今后新的治療靶點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：慢性阻塞性肺疾?。还趋兰∥s；蛋白質(zhì)

近年來，慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）的發(fā)病率和病死率正逐年增加，不是一種單純的肺部疾病，而是可以累及引起全身炎癥、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨骼肌萎縮、骨質(zhì)疏松等具有廣泛的肺外損傷的全身疾病，尤其是不明原因的骨骼肌萎縮和體重減輕及功能障礙[1]。分析與肌肉萎縮相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)及其功能可能對治療具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1蛋白質(zhì)取材 30例老年人，年齡均在70～90歲，無COPD組（正常組）10例，COPD患者無外周骨骼肌萎縮組（無萎縮組）10例，COPD患者存在外周骨骼肌萎縮組（萎縮組）10例，分別取髕骨上15cm股四頭肌的外側(cè)??；所有肌肉樣品，在切取后立刻用冰的PBS沖洗，去掉組織中殘留的血液等，剪成碎片置于1.5ml Eppenderf管中，并儲存于-80℃。

1.2方法

1.2.1蛋白質(zhì)的制備：將收集完的樣品，用電子天平稱取等重量樣品（50mg）用預(yù)冷的0.01 mol·L-1PBS：（磷酸鹽緩沖液）洗滌3次，預(yù)冷的蒸餾水洗滌1次，出去渣滓，在液氮中制動研磨至粉末狀，加適量裂解液充分混勻，在4℃冰浴靜置15min，冰浴超聲、離心，后取上清，用bradford法測其標(biāo)本的濃度，分別取樣本量1000μg均于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2雙向凝膠電泳、染色劑脫色：第一向等點(diǎn)聚焦：從冰箱中取出IPG（17mm PH3-10）預(yù)制膠條分成三組，經(jīng)過與溶脹緩沖液充分混合、稀釋、過濾、蒸發(fā)制成膠條立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳。第二向SDS-PAGE電泳：拿出膠條放在平衡緩沖液Ⅰ中水平緩慢搖動平衡，再轉(zhuǎn)移至平衡緩沖液Ⅱ中水平緩慢搖動平衡等一系列處理后凝膠，進(jìn)行染色、脫色。

1.2.3蛋白圖象采集與分析：染色、脫色完成后的雙向電泳凝膠，用凝膠圖像掃描儀透射掃描獲得圖像，發(fā)送圖象至ImageMaster的軟件分析程序進(jìn)行下一步凝膠圖象的分析。蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測，調(diào)整峰值、邊緣以及利用子模式中的增刪、分割等找出代表同一蛋白質(zhì)的點(diǎn)，以比較不同凝膠中的蛋白表達(dá)情況。

1.2.4膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜分析：選擇雙向凝膠電泳匹配后找到的差異非常顯著的蛋白點(diǎn)自動匹配，將電泳后凝膠中差異非常顯著的蛋白點(diǎn)切出，反復(fù)清洗，脫色后的膠塊在真空離心干燥機(jī)內(nèi)干燥，使膠塊完全脫水體積縮小成近似球狀，離心干燥。所有的PMF質(zhì)譜圖MALDI-TOF-MS分析，通過PMF鑒定蛋白質(zhì)可以根據(jù)分子量、等電點(diǎn)、肽段匹配數(shù)、尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包方差分析及顯著性t 檢驗(yàn)。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)均用（x±s）表示，P值<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1蛋白質(zhì)的濃度測定結(jié)果 經(jīng)過Bradford法測得樣本蛋白質(zhì)的濃度為，正常組8.31μg/μl，非萎縮組：10.61μg/μl，萎縮組9.54μg/μl。

2.2雙向凝膠電泳圖 見圖1。

2.3差異表達(dá)蛋白 根據(jù)蛋白點(diǎn)的面積、灰度值及光密度值等參數(shù)，用ImageMaster2D Platinum Software軟件對正常組、萎縮組、非萎縮組蛋白圖譜進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)COPD患者蛋白圖譜中有17個蛋白斑點(diǎn)表達(dá)量與正常組有顯著差異（差異為Vol%值上調(diào)或下調(diào)2倍以上），用胰蛋白酶消化后，進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測，得到肽質(zhì)量指紋譜。徑Mascot查詢SWISSPROT數(shù)據(jù)庫，結(jié)合2-DE凝膠上蛋白點(diǎn)的分子量和等電點(diǎn)，得分超過66分（P<0.05）將被認(rèn)為是可靠鑒定的結(jié)果，其中有10個超過66分，推測功能性蛋白可能為烯醇酶-1，碳酸脫水酶（碳酸脫水酶Ⅲ），肌鈣蛋白T和幾種血紅蛋白。

3 討論

通過蛋白組學(xué)的方法比較正常組、非萎縮組、萎縮組的蛋白表達(dá)量的差異，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾個功能性蛋白表達(dá)量在三組中有著明顯的差異。以下將逐一詳細(xì)討論。

3.1烯醇酶-1（ENO1） 烯醇酶-1，是一種存在于肌肉等組織里的酶，在碳水化合物的新陳代謝中起著重要作用。在糖類的發(fā)酵、酵解中，此能量通過丙酮酸激酶的作用用于ATP的生成；還能與細(xì)胞骨架蛋白和多聚核苷酸結(jié)合[1-2]，是纖溶酶原、層粘連蛋白的受體等[3]，ENO1作為纖維蛋白溶酶原受體、纖維蛋白溶酶原結(jié)合蛋白，將纖維蛋白溶酶原結(jié)合于細(xì)胞周圍并促其活化，活化的纖維蛋白溶酶原發(fā)揮其蛋白水解酶的作用，激活纖溶酶其表達(dá)增加將使成肌細(xì)胞表面纖溶酶的產(chǎn)生增加。在本研實(shí)驗(yàn)究中，我們發(fā)現(xiàn)無論是非萎縮組還是萎縮組表達(dá)量都是上調(diào)的；推測可能在患者在長期慢性缺氧時(shí)，出現(xiàn)有氧呼吸的ATP能量生成不足，使得烯醇酶-1表達(dá)量增加來促進(jìn)ATP生成，這是與COPD患者氧通氣不足引起的無氧呼吸糖酵解是相吻合的；當(dāng)缺氧進(jìn)一步加重時(shí)，可能出現(xiàn)烯醇酶啟動纖溶酶系統(tǒng)開始分解骨骼肌肌纖維，來滿足能量的不足，進(jìn)而引起骨骼肌纖維的減少，即發(fā)生骨骼肌的萎縮；國內(nèi)外并未見有關(guān)于COPD患者骨骼肌蛋白酶在調(diào)節(jié)骨骼肌萎縮上報(bào)道，可能還存在其他途徑能使該蛋白酶在表達(dá)量上的變化，其具體途徑仍需要進(jìn)一步的研究，分析該蛋白酶在調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白分解及代謝上的分子機(jī)制。

3.2碳酸脫水酶Ⅲ（CAⅢ） 碳酸脫水酶Ⅲ是碳酸苷酶的一種，它們都具有共同的主要功能：①在血液及其他組織中維持酸堿平衡；②幫助體內(nèi)組織排除二氧化碳；③確保以CO2和HCO3-為催化底物的酶保持適度的底物濃度，參與體內(nèi)酸堿平衡調(diào)節(jié)及離子交換等過程起重要的作用；碳酸酐酶是紅細(xì)胞的主要蛋白質(zhì)成分之一，在紅細(xì)胞中的地位僅次于血紅蛋白；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，存在有兩種形式碳酸脫水酶同工酶，根據(jù)肽段的匹配更接近與碳酸酐酶Ⅲ（CAⅢ）的結(jié)構(gòu)，CAⅢ肽鏈均由259個氨基酸組成；就目前的了解，CAⅢ除上述功能外，可能存在的生理作用主要有3點(diǎn)：①由于CAⅢ具有水化酶的功能，因此可以促進(jìn)將I型肌纖維代謝過程中產(chǎn)生的CO2運(yùn)送出細(xì)胞；②由于CAⅢ具有磷酸酶活性，它可能參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；③由于肝臟，脂肪細(xì)胞和骨骼肌的功能均與能量代謝有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，在重癥肌無力患者的骨骼肌上測得CAⅢ蛋白的表達(dá)水平明顯減少[4]。對于重癥肌無力骨骼肌中CAⅢ蛋白缺乏的認(rèn)識，其可能與骨骼肌的易疲勞和收縮無力有關(guān)[5]。本研究結(jié)果分析，CAⅢ均在非萎縮組及萎縮組都明顯的升高，當(dāng)在copd患者中，推測原因有兩種，①由于CO2的儲留引起碳酸的升高，故體內(nèi)的PH降低，機(jī)體為調(diào)解體內(nèi)的酸堿平衡，促進(jìn)CAⅢ的生成來維持機(jī)體的酸堿平衡，促進(jìn)CO2排除細(xì)胞外而維持體內(nèi)酸堿平衡；②由于患者的運(yùn)動耐力減弱、骨骼肌收縮力減弱，機(jī)體為增加肌肉收縮力而對CAⅢ增加的調(diào)節(jié)，來抵抗肌力的下降；這一點(diǎn)與上述理論是相吻合的，另外CAⅢ還具有磷酸酶的活性，磷酸酶是細(xì)胞信號傳到的一種重要的酶，故CAⅢ是否在信號傳導(dǎo)上存在對骨骼肌的調(diào)節(jié)？是否還參與copd患者外周骨骼肌蛋白的分解等的作用分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3肌鈣蛋白T（TnT） 肌鈣蛋白位于肌纖維之中，是橫紋肌收縮的重要調(diào)節(jié)蛋白，是調(diào)節(jié)Ca2+的可逆作為肌肉收縮離合開關(guān)。肌鈣蛋白T（TnT）是肌鈣蛋白其中1個亞基，在骨骼肌收縮和舒張過程中起重要調(diào)節(jié)作用，與原肌球蛋白結(jié)合，是肌肉的主要調(diào)節(jié)蛋白；本實(shí)驗(yàn)研究慢肌中的肌鈣蛋白T同工型在非萎縮組和萎縮組均有明顯的升高，但在后期發(fā)生骨骼肌萎縮時(shí)，肌鈣蛋白T有所下降，但還高于正常組，根據(jù)以上的理論與實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析認(rèn)為在copd初期未發(fā)展到骨骼肌萎縮時(shí)，骨骼肌收縮與舒張較正常下降，機(jī)體為抵抗骨骼肌功能的減弱，增加肌鈣蛋白T同工型來結(jié)合鈣離子增加粗肌絲與細(xì)肌絲的運(yùn)動，增加骨骼肌的運(yùn)動耐力，維持正常運(yùn)動。推測copd患者缺氧逐漸加重、病情逐漸發(fā)展，合成ATP進(jìn)一步的減少，甚至發(fā)展到合成ATP不足，引起骨骼肌蛋白的分解來彌補(bǔ)供能的不足，即骨骼肌纖維的減少，發(fā)生萎縮，故肌鈣蛋白T較前有所下降；但在研究肌鈣蛋白T在骨骼肌上的很少，是否也存在骨骼肌的壞死、降解等機(jī)制仍不清楚，其分子機(jī)制還待進(jìn)一步的研究。

總之，目前工作證明了使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析骨骼肌萎縮相關(guān)蛋白質(zhì)的可行性和有效性。本研究方法及結(jié)果將給人的骨骼肌肌肉萎縮原因帶來的可能理解，并能對臨床診斷或者藥物發(fā)現(xiàn)的潛在目的，篩選一些\"疾病特異蛋白\"提供幫助。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sousa L P，Brasil B S，Silva BdeM，et al.Characterization of alpha-enolase as an interferon alpha alpha 1 regulated gene [J].Front Biosci，2012，10 （5）：2534-2547.

[2]Ghosh A K，Steele R，Ray R B.C2myc p romoter binding p rotein1（MBP-1） regulates p rostate cancer cell growth by inhibitingMAPK pathway[J].JBiol Chem，2005，280（14）：14325-14330.

[3] Lopez Alemany R，SuelvesM，Diaz Ramos A，et al.Alpha-enolase plasminogen recep tor in myogenesis [J].Front Biosci，2005，10（1）：30-36.

[4]都愛蓮，任惠民，呂傳真，等.P25蛋白在重癥肌無力患者中的低表達(dá)及組織和種屬特異性的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84：103-106.

[5]涂江龍，任惠民，呂傳真，等.重癥肌無力患者骨骼肌中碳酸酐酶Ⅲ蛋白減少的原因[J].中華神經(jīng)科雜志，2007，40：207-211.編輯/哈濤