加味五皮飲對(duì)OHSS模型大鼠E2、IL—6和VEGF的實(shí)驗(yàn)研究

摘要：目的 觀察加味五皮飲是否能夠抑制OHSS模型大鼠外周血清IL-6和E2水平，能否降低OHSS模型大鼠卵巢重量、VEGF蛋白在卵巢上表達(dá)水平，從而對(duì)OHSS的發(fā)生起到防治作用。方法 選用未成年雌性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分成模型中藥組、模型對(duì)照組每組15只。將兩組未成年雌性Wistar大鼠采用PMSG+hCG方式建立OHSS模型，同時(shí)給予加味五皮飲和生理鹽水灌胃。HCG注射48h后，沿腹部中線切開腹腔，取出大鼠雙側(cè)卵巢稱重，采用免疫組化對(duì)大鼠卵巢組織VEGF蛋白表達(dá)的測(cè)定；分別用ELISA和RIA檢測(cè)血清中IL-6和E2水平。結(jié)果 模型中藥組卵巢重量、卵巢VEGF蛋白表達(dá)、血清E2和IL-6水平與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。結(jié)論 加味五皮飲可以降低OHSS大鼠卵巢的重量、外周血IL-6、E2水平、卵巢組織中VEGF的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：卵巢過(guò)度刺激綜合征；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；雌二醇；白介素6

卵巢過(guò)度刺激綜合征是一種在排卵誘導(dǎo)治療導(dǎo)致的醫(yī)源性并發(fā)癥，在接受輔助生殖治療時(shí)最為常見，嚴(yán)重的OHSS可危及生命。嚴(yán)重OHSS的臨床特點(diǎn)包括卵巢腫大、腹脹、腹水、惡心、嘔吐、電解質(zhì)紊亂、低血容量、少尿、腎功能衰竭、胸腔積液、血液濃縮、血栓栓塞現(xiàn)象（腦血管疾病和心肌梗死），甚至死亡。由于輔助生殖技術(shù)的高速發(fā)展和推廣，輔助生殖治療不孕不育的需求不斷增加。有報(bào)道稱，OHSS所有類型的發(fā)病率從1%到高達(dá)23%的范圍內(nèi)是高度變化的，并且在所有治療周期中的嚴(yán)重類型的發(fā)病率高達(dá)5%，特別是在發(fā)展中國(guó)家[1]。隨著對(duì)OHSS研究的深入，其發(fā)病機(jī)制以及病理表現(xiàn)得以充分闡述，但仍然未完全清楚。本研究通過(guò)對(duì)OHSS模型大鼠造模同時(shí)給予中藥干預(yù)，來(lái)觀察其療效，為臨床上防治奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用未成年雌性Wistar大鼠（SPF級(jí)）30只，22d齡，體重平均（49.2±4.5）g，購(gòu)于長(zhǎng)沙東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部。大鼠飼養(yǎng)于相同環(huán)境，自由攝水飲食，室溫20℃～22℃，相對(duì)濕度為40%～60%。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 按體質(zhì)量大小編號(hào)，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將30只雌性Wistar大鼠，隨機(jī)共分為兩組：模型中藥組、模型對(duì)照組，每組15只。

1.3主要試劑與儀器 免疫組化一抗試劑，購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；PV-9000試劑與DAB顯色劑，購(gòu)于北京中杉金橋； 白介素6檢測(cè)試劑盒， 購(gòu)于武漢優(yōu)爾生；雌二醇放免測(cè)定盒，購(gòu)于北京華英生物技術(shù)研究所。酶標(biāo)儀（丹麥RAYTO公司）；722型可見光分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀（中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司）；高倍光學(xué)顯微（德國(guó)LEICA公司）。

1.4方法

1.4.1 OHSS大鼠模型建立 按改良的Ujioka方法[2]對(duì)30只未成年雌性Wistar大鼠建立OHSS模型。每只大鼠從22～25d齡連續(xù) 4d皮下注射含有10IU PMSG的生理鹽水0.1ml，1次/d；26日齡（最后一次注射 PMSG后24h）皮下注射含有100IU hCG生理鹽水0.1ml 1次。注射用人絨毛膜促性腺激素1000IU/支，妊娠雌馬血清促性腺激素1000IU/支。

1.4.2中藥及給藥劑量 根據(jù)補(bǔ)腎健脾活血利濕法，以《華氏中藏經(jīng)》中五皮飲為基礎(chǔ)方進(jìn)行加味擬方，具體中藥飲片如下：陳皮、茯苓皮、生姜皮、桑白皮、大腹皮各20g、菟絲子15g、桑寄生15g、黃芪12g、白術(shù)12g、當(dāng)歸10、黨參12g，以上藥物用水浸泡30min，加熱沸騰后小火微沸30min，過(guò)濾，使生藥含量為1g/ml水煎劑。于造模同時(shí)，模型中藥組、模型對(duì)照組分別予以加味五皮飲和生理鹽水2ml灌胃進(jìn)行干預(yù)，1次/d，連用7d。按動(dòng)物體表面積比率換算等效劑量，公式：大鼠劑量（g）=人用劑量（g）×0.018×5。得出加味五皮飲給藥劑量為：1.575g/100g/d。

1.4.3標(biāo)本采集 HCG注射48h后即28d齡時(shí)，肌肉注射用苯巴比妥鈉（80mg/kg） 麻醉30只OHSS模型大鼠，20min后股靜脈采血2ml于試管中，待血液標(biāo)本凝固后，離心（3000r/min、10min）吸取血清-20℃保存?zhèn)錂z；沿腹部正中線切開大鼠腹腔，取出卵巢組織并稱重，脫頸處死大鼠，放入裝有福爾馬林的PE管內(nèi)固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，用于免疫組化染色。

1.4.4指標(biāo)測(cè)定 血清中E2測(cè)定用放射免疫法檢測(cè)，IL-6測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定。卵巢中VEGF蛋白測(cè)定采用免疫組化PV二步法，應(yīng)用MIQAS醫(yī)學(xué)圖象定量分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選5個(gè)有意義的視野，在同等條件下測(cè)量VEGF的陽(yáng)性光密度值，取平均值為該切片的光密度值，同時(shí)測(cè)量陽(yáng)性面積，并計(jì)算出陽(yáng)性面積比（陽(yáng)性面積/總面積），最后導(dǎo)入公式中計(jì)算出免疫組化陽(yáng)性指數(shù)。免疫組化陽(yáng)性指數(shù)=陽(yáng)性面積比×平均光密度值。陽(yáng)性指數(shù)越大，陽(yáng)性表達(dá)越高。

1.5統(tǒng)計(jì)分析 采用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來(lái)表示；計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠卵巢重量 肉眼觀察下模型中藥組、模型對(duì)照組的OHSS模型wistar大鼠雙側(cè)卵巢明顯增大，呈多囊改變，可見多個(gè)卵泡。模型中藥組與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），模型中藥組大鼠雙側(cè)卵巢重量低于模型對(duì)照組。見表1。

2.2 LI-6與E2含量 采用EILSA檢測(cè)方法，于酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處讀取各空OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=27.72x2-118.57x+67.283，R2=0.9872。各組大鼠血清中IL6的含量結(jié)果，統(tǒng)計(jì)分析后得出，模型對(duì)照組與模型中藥組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），模型中藥組大鼠血清中IL6含量要低于模型對(duì)照組。采用放射免疫法檢測(cè)方法，檢測(cè)各組大鼠血清中E2的含量結(jié)果進(jìn)統(tǒng)計(jì)分析得出，模型對(duì)照組與模型中藥組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），模型中藥組大鼠血清中E2含量要低于模型對(duì)照組。見表2。

2.3大鼠卵巢VEGF檢測(cè)結(jié)果 各組大鼠卵巢組織中VEGF在黃體細(xì)胞、卵泡顆粒細(xì)胞胞漿中均有表達(dá)，呈黃色，應(yīng)用MIQAS醫(yī)學(xué)圖象定量分析系統(tǒng)，對(duì)兩組大鼠卵巢組織圖像進(jìn)行分析，測(cè)量免疫組化圖像中陽(yáng)性區(qū)域面積比以及光密度值，計(jì)算出免疫組化陽(yáng)性指數(shù)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)得出結(jié)果為：模型對(duì)照組與模型中藥組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），模型中藥組組免疫組化陽(yáng)性指數(shù)要低于模型對(duì)照組，見表3。

3 討論

OHSS主要是由于卵巢在促性腺激素的刺激下，卵巢過(guò)度刺激導(dǎo)致血管活性物質(zhì)增多，導(dǎo)致多個(gè)臟器功能障礙一種全身性疾病。卵巢過(guò)度刺激后所表現(xiàn)的主要特點(diǎn)為：大量的卵泡產(chǎn)生、血清中雌二醇的水平身高以及卵巢體積增大。導(dǎo)致該綜合征出現(xiàn)的發(fā)病機(jī)制主要是，血管通透性增高，血管內(nèi)液體滲出增多，血管內(nèi)血液濃縮從而降低了組織器官的灌流量；同樣，血液在血管內(nèi)呈凝固趨勢(shì)，提高了血栓形成以及血栓栓塞的概率，并且過(guò)度的滲出液將導(dǎo)致組織間隙的水腫，引起胸腹腔積液，甚至是肺水腫。hCG的應(yīng)用不僅是誘發(fā)卵母細(xì)胞成熟關(guān)鍵的一步，同樣也是在控制性超排卵后，誘發(fā)OHSS發(fā)生的先決條件[3]。因?yàn)槭褂胔CG可以誘導(dǎo)多個(gè)卵泡和黃體的形成，顆粒細(xì)胞中的VEGF mRNA水平增高，從而產(chǎn)生大量的VEGF，表達(dá)在卵巢中，引起血管通透性增加[4-6]。通過(guò)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR-2），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子刺激新血管的產(chǎn)生并且使血管通透性升高[7-9]。在OHSS的發(fā)病機(jī)制中除了由VEGF介導(dǎo)的卵泡血管生成和毛細(xì)血管通透性升高外，還有包括免疫系統(tǒng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)RAS[10，11]。

雌二醇與OHSS的發(fā)生有著密切的關(guān)系，據(jù)報(bào)道在大多數(shù)預(yù)測(cè)OHSS發(fā)生的方法中，檢測(cè)血清中E2是最重要的一項(xiàng)指標(biāo)[12]。Asch等[13]通過(guò)臨床對(duì)OHSS發(fā)病率的研究中發(fā)現(xiàn)，如IVF-ET患者血清E2 水平在>6000IU/ L 和3500～5999IU之間時(shí)，OHSS的發(fā)生機(jī)率分別是38%、1.5%，低于3500IU/ L時(shí)，未出現(xiàn)1例OHSS的發(fā)生。有研究指出，在月經(jīng)周期第9d時(shí)血清中E2>800pg/ml時(shí)，發(fā)生OHSS的風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)升高[14]。Arianna等[15]研究發(fā)現(xiàn)在卵巢刺激的第11d，婦女血清中E2含量為3354pg/ml時(shí)，發(fā)展為OHSS的風(fēng)險(xiǎn)將高達(dá)85%。當(dāng)血清中E2水平在最初的2～3中加倍升高，且高達(dá)3000pg/ml并且出現(xiàn)多個(gè)卵泡快速增長(zhǎng)時(shí)，提示要進(jìn)行干預(yù)，謹(jǐn)防發(fā)生OHSS。Navot 等[16]指出，應(yīng)用HCG出現(xiàn)血清中E2急劇上升并且卵巢中出現(xiàn)30個(gè)以上的卵泡，將提示重度OHSS的發(fā)生。盡管血清中E2 過(guò)高導(dǎo)致OHSS發(fā)生確切機(jī)制不明確，但是與雌激素的生物學(xué)效能有一定的關(guān)系，它具有增強(qiáng)肝臟合成血管緊張素（AT）、擴(kuò)張血管、促使水鈉儲(chǔ)留并可的作用，雌激素水平增高的同時(shí)也會(huì)引起了體內(nèi)一些細(xì)胞因子的升高，因此低水平的E2 能夠有效的防止OHSS的發(fā)生[17-19]。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)無(wú)OHSS的相關(guān)記載記載， 但通過(guò)臨床癥狀如卵巢增大、胸腹腔積液、全身水腫等體征，可結(jié)合中醫(yī)學(xué)中子腫、臌脹、癥瘕等范疇。根據(jù)中醫(yī)理論，認(rèn)為其病變涉及肺、脾、肝、腎等臟腑。五皮飲方由生姜皮、桑白皮、大腹皮、茯苓皮、廣陳皮五種藥物組成。方中以茯苓皮利水滲濕，兼以補(bǔ)脾助運(yùn)化；生姜皮散水飲；桑白皮肅將肺氣，以通調(diào)水道；大腹皮行水氣，消脹滿；陳橘皮和胃氣，化濕濁五藥相合，在本方基礎(chǔ)上加以菟絲子、桑寄生、黃芪、白術(shù)、當(dāng)歸、黨參，從而能夠達(dá)共奏理氣健脾，利濕消腫之效。

在研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)加味五皮飲能夠減輕卵巢重量并且有效的抑制OHSS模型大鼠血清中E2、IL-6水平及降低VEGF蛋白在卵巢表達(dá)。通過(guò)本次研究為臨床上防治OHSS奠定了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Schenker J G， Weinstein D. Ovarian hyperstimulation syndrome： a current survey[J]. Fertility and sterility， 1978， 30（3）：255-268.

[2]付永倫，林其德，仲汗威.卵巢過(guò)度刺激綜合征大鼠模型建立[J].上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)， 2002，24（01）：16-19.

[3]Aboulghar M A， Mansour R T. Ovarian hyperstimulation syndrome： classifications and critical analysis of preventive measures[J]. Human Reproduction Update， 2003， 9（3）：275-289.

[4]Yan Z P， Weich H A， Bernart W， et al. Vascular endothelial growth-factor （vegf） messenger-ribonucleic-acid （messenger-rna） expression in luteinized human granulosa-cells in-vitro[J]. Journal Of Clinical Endocrinology Metabolism， 1993， 77（6）：1723-1725.

[5]Neulen J， Yan Z P， Raczek S， et al. Human chorionic gonadotropin-dependent expression of vascular endothelial growth-factor vascular-permeability factor in human granulosa-cells - importance in ovarian hyperstimulation syndrome[J]. Journal Of Clinical Endocrinology Metabolism， 1995， 80（6）：1967-1971.

[6]Wang T H， Horng S G， Chang C L， et al. Human chorionic gonadotropin-induced ovarian hyperstimulation syndrome is associated with up-regulation of vascular endothelial growth factor[J]. Journal Of Clinical Endocrinology Metabolism， 2002， 87（7）：3300-3308.

[7]McClure N， Healy D L， Rogers P A W， et al. Vascular endothelial growth-factor as capillary-permeability agent in ovarian hyperstimulation syndrome[J]. Lancet， 1994， 344（8917）：235-236.

[8]Bates D O， Harper S J. Regulation of vascular permeability by vascular endothelial growth factors[J]. Vascular Pharmacology， 2002， 39（4-5）：225-237.

[9]Gille H， Kowalski J， Li B， et al. Analysis of biological effects and signaling properties of Flt-1 （VEGFR-1） and KDR （VEGFR-2） - A reassessment using novel receptor-specific vascular endothelial growth factor mutants[J]. Journal Of Biological Chemistry， 2001， 276（5）：3222-3230.

[10]Orvieto R， BenRafael Z. The immune system in severe ovarian hyperstimulation syndrome[J]. Israel Journal Of Medical Sciences， 1996， 32（12）：1180-1182.

[11]Vloeberghs V， Peeraer K， Pexsters A， et al. Ovarian hyperstimulation syndrome and complications of ART[J]. Best Practice Research Clinical Obstetrics Gynaecology， 2009， 23（5）：691-709.

[12]Chen D， Burmeister L， Goldschlag D， et al. Ovarian hyperstimulation syndrome： strategies for prevention[J]. Reproductive biomedicine online， 2003， 7（1）：43-49.

[13]Asch R H， Li H P， Balmaceda J P， et al. Severe ovarian hyperstimulation syndrome in assisted reproductive technology： definition of high risk groups[J]. Hum Reprod， 1991， 6（10）：1395-1399.

[14]Ho H Y， Lee R K K， Lin M H， et al. Estradiol level on day 9 as a predictor of risk for ovarian hyperresponse during controlled ovarian hyperstimulation[J]. Journal Of Assisted Reproduction And Genetics， 2003， 20（6）：222-226.

[15]D'Angelo A， Davies R， Salah E， et al. Value of the serum estradiol level for preventing ovarian hyperstimulation syndrome： a retrospective case control study[J]. Fertility and Sterility， 2004， 81（2）：332-336.

[16]Navot D， Relou A， Birkenfeld A， et al. Risk factors and prognostic variables in the ovarian hyperstimulation syndrome[J]. Am J Obstet Gynecol， 1988， 159（1）：210-215.

[17]Borase H， Mathur R. Ovarian hyperstimulation syndrome： clinical features， prevention and management[J]. Obstetrics， Gynaecology Reproductive Medicine， 2012， 22（7）：186-190.

[18]Chen C-D，Chen S-U， Yang Y-S. Prevention and management of ovarian hyperstimulation syndrome[J]. Best Practice Research Clinical Obstetrics Gynaecology， 2012， 26（6）：817-827.

[19]Orvieto R. Etiology of ovarian hyperstimulation syndrome[J]. Fertility and Sterility， 2012， 97（6）：e27.

編輯/哈濤