細(xì)胞周期蛋白D1、p16蛋白在膽汁反流性胃炎中的表達(dá)及意義

徐曉玲 朱海杭 王翠梅 曹 麗 凡蘭桂 沈 琴 印 健

膽汁反流性胃炎（BRG）是慢性胃炎中一種較常見的類型，是由十二指腸胃反流引起的胃黏膜化學(xué)性炎性反應(yīng)，與萎縮、腸化生等胃黏膜癌前病變有關(guān)［1］。膽汁反流可致胃小凹上皮增生，Dixon等［1］通過病理研究發(fā)現(xiàn)，膽汁反流可能與胃竇黏膜腸上皮化生有關(guān)，但其對(duì)胃上皮細(xì)胞生長的影響尚不明確，其是否有癌變傾向，以及與胃癌的關(guān)系需要進(jìn)一步研究探討。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，也是一種原癌基因，Cyclin D1蛋白過表達(dá)可以促使細(xì)胞增殖。抑癌基因p16是細(xì)胞周期的負(fù)向調(diào)控因子，對(duì)于細(xì)胞周期的調(diào)控作用突出，已成為腫瘤診斷的參考指標(biāo)之一。有研究表明，Cyclin D1蛋白過表達(dá)、p16基因缺失與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，且是胃癌發(fā)生的早期事件［2－5］。本研究通過檢測(cè)正常胃黏膜、BRG、癌旁組織、胃癌中的Cyclin D1、p16表達(dá)水平，探討B(tài)RG與胃癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2012年6月至2012年12月在本院病理科存檔的胃癌標(biāo)本50例，同時(shí)取癌旁組織50例（距離腫瘤組織邊緣3～5 c m）。另隨機(jī)選取2012年6月至2012年12月在本院消化內(nèi)鏡中心診斷的BRG組織標(biāo)本50例（BRG納入標(biāo)準(zhǔn)為胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)黏液湖膽染，伴胃竇黏膜糜爛，伴或不伴有充血者），正常胃黏膜（即健康體檢者，內(nèi)鏡下觀察黏膜光滑，無水腫、出血、糜爛等表現(xiàn)）組織標(biāo)本50例，對(duì)患者的年齡、性別等方面進(jìn)行比較，顯示差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

標(biāo)本常規(guī)行4μm連續(xù)切片，每例均行蘇木精－伊紅（HE）染色和免疫組織化學(xué)染色，光鏡觀察。免疫組織化學(xué)對(duì)照：以Cyclin D1、p16陽性的胃癌組織切片作為陽性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。主要試劑：Cyclin D1兔抗人單克隆抗體、p16兔抗人單克隆抗體、兔超敏二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒及DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 觀察指標(biāo)

p16蛋白的陽性判斷參照Geradts等［6］的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

Cyclin D1蛋白染色陽性為在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，且其著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者。每例切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行結(jié)果判定。按染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合計(jì)分。染色強(qiáng)度：無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。陽性細(xì)胞數(shù)：小于總數(shù)的5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，大于50%計(jì)3分。染色強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞數(shù)得分相乘，0分計(jì)為陰性（－），1～3分計(jì)為弱陽性（＋），4～5分計(jì)為中度陽性（＋＋），≥6分計(jì)為強(qiáng)陽性（＋＋＋）［5］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cyclin D1、p16染色特征

采用En Vision法，見圖1。

2.2 Cyclin D1、p16在不同類型組織的表達(dá)

Cyclin D1在正常胃黏膜、BRG、癌旁組織、胃癌中的陽性表達(dá)率逐漸升高，在BRG中的陽性表達(dá)率顯著高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。p16在正常胃黏膜、BRG、癌旁組織、胃癌中的陽性表達(dá)率逐漸降低，在BRG中的陽性表達(dá)率顯著低于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但Cyclin D1、p16在BRG、癌旁組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 Cyclin D1、p16在不同類型組織中的表達(dá)情況

2.3 腸上皮化生和不典型增生檢出率

BRG中的腸上皮化生檢出率高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。BRG中的不典型增生檢出率也高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 腸上皮化生和不典型增生在BRG和正常胃黏膜組織中的檢出率

3 討論

BRG是由于幽門功能不全，胃竇十二指腸協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)障礙，胃排空延遲或膽囊功能障礙等因素導(dǎo)致過量含膽汁的十二指腸液反流入胃，破壞胃黏膜表面的黏液屏障，損傷黏膜上皮，引起黏膜充血水腫等炎性改變，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，主要依靠胃鏡診斷，在病理學(xué)上存在一定比例的腸上皮化生和不典型增生。研究表明，長期膽汁反流可致胃小凹上皮增生和反流性食管炎鱗狀上皮增生，并可能與腸化生甚至癌變有關(guān)。Barrett食管中膽汁反流可能是重要的致癌因素［7－9］。

有報(bào)道BRG與胃黏膜腸上皮化生相關(guān)，存在胃黏膜腸上皮化生的患者其胃內(nèi)總膽酸的濃度明顯高于無腸上皮化生者［10－11］。王學(xué)偉等［12］對(duì)大鼠膽汁反流模型研究發(fā)現(xiàn)，長期膽汁反流可導(dǎo)致大鼠胃黏膜腺上皮和鱗狀上皮顯著增生，并發(fā)生異型增生和癌變。本研究中BRG腸上皮化生和不典型增生檢出率顯著高于正常胃黏膜組，提示BRG可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)。

Cyclin D是一組控制真核細(xì)胞周期進(jìn)展的重要蛋白分子，Cyclin D1是其重要的亞型。Cyclin D1可結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）形成復(fù)合物Cyclin D1－CDK4，使Rb蛋白磷酸化，解除Rb基因調(diào)控G期停滯的作用，使細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。Motokura等［13］研究指出，在生理狀態(tài)下，細(xì)胞進(jìn)入S期后Cyclin D1迅速分解。當(dāng)Cyclin D1過度表達(dá)時(shí)，能縮短G1期，促使細(xì)胞提前進(jìn)入S期。Cyclin D1基因的過度表達(dá)發(fā)生在胃黏膜上皮癌變的早期階段，是重要的胃癌促發(fā)因素，其表達(dá)與胃癌的病理學(xué)類型、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等沒有相關(guān)性。該基因可能作為一個(gè)潛在的胃癌早期診斷分子標(biāo)志物，是癌變?cè)缙诘姆肿邮录唬?，14］。

p16為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白，是一種多瘤抑制基因。Kamb等［15－16］報(bào)道，p16可通過與細(xì)胞周期蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合周期蛋白依賴性激酶，從而抑制Cyclin D1－CDK4或CDK6的活性，降低抑癌基因Rb的磷酸化，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在細(xì)胞周期調(diào)控中，p16的失活和其缺失或突變?cè)谀[瘤發(fā)生過程中起著重要作用。p16基因表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G1期阻滯［17］。有研究表明，胃癌及其癌前病變中均存在p16基因甲基化，表明p16蛋白產(chǎn)物缺失或喪失活性發(fā)生在胃黏膜上皮癌變的早期階段，是重要的胃癌促發(fā)因素。p16基因也可作為一個(gè)潛在的胃癌早期診斷的分子標(biāo)志物［18－19］。

本研究顯示，隨著胃黏膜病變的進(jìn)展，p16蛋白的陽性表達(dá)率下降，而Cyclin D1的陽性表達(dá)率升高。在正常胃黏膜組織和BRG組織中p16的表達(dá)率高于Cyclin D1的表達(dá)，而在胃癌組織中p16的表達(dá)率低于Cyclin D1。兩者在癌旁組織和BRG組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明Cyclin D1基因擴(kuò)增和／或過度表達(dá)可引起腫瘤細(xì)胞異常增殖，p16基因缺失或突變而不能正常表達(dá)時(shí)也能引起腫瘤細(xì)胞異常增殖。提示BRG可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多階段逐步演進(jìn)的過程，其中細(xì)胞周期的調(diào)控直接或間接影響著其進(jìn)程［20］。Kishi moto等［21］發(fā)現(xiàn)胃癌在發(fā)生發(fā)展過程中至少需要2個(gè)活化癌基因的異常表達(dá)，近40%～50%的病例中出現(xiàn)p16／Rb缺失和Cyclin D1／CDK4過表達(dá)。

本研究表明，當(dāng)p16蛋白減少時(shí)，Cyclin D1蛋白表達(dá)量卻升高，使其能與CDK4更大程度地結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，進(jìn)而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生進(jìn)展。p16蛋白與Cyclin D1蛋白表達(dá)可能呈反饋調(diào)節(jié)關(guān)系，參與胃癌的發(fā)生。因此，聯(lián)合檢測(cè)胃黏膜組織中Cyclin D1、p16的表達(dá)，對(duì)胃癌早診斷、早治療及預(yù)后評(píng)估有一定的參考價(jià)值。本研究中Cyclin D1和p16在BRG中都存在異常表達(dá)，提示BRG可能有癌變傾向。

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