黃酒釀造浸米水中抑菌物質(zhì)的分離純化鑒定及其活性的測(cè)定

成瀟龍，楊海麟 *，章 升，張無疾，王 鑫，單之初，沈 翔，潘興祥

（1.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 312000；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214000）

冬釀是傳統(tǒng)紹興黃酒生產(chǎn)的一大特點(diǎn)。在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，冬天長(zhǎng)時(shí)間浸米（最長(zhǎng)可達(dá)18 d）是傳統(tǒng)紹興黃酒生產(chǎn)工藝的一大特點(diǎn)[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紹興黃酒釀造工藝浸米過程的研究不多。黃酒浸米的主要目的是讓米充分吸水，易于蒸煮糊化，同時(shí)進(jìn)行乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸，起到以酸制酸，保證黃酒在開放式發(fā)酵中能夠正常和順利進(jìn)行[2]。陳儲(chǔ)是傳統(tǒng)紹興黃酒生產(chǎn)中最后的一個(gè)環(huán)節(jié)，優(yōu)質(zhì)的紹興黃酒能夠長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存不壞，并且在漫長(zhǎng)的陳儲(chǔ)過程中生香生酯，使口感更佳柔和醇厚[3]。在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，相同工藝、相同底物發(fā)酵濃度釀成的紹興酒，因浸米時(shí)間的不同，其貯藏的安全性不一致，浸米時(shí)間長(zhǎng)釀得的酒，入壇后能夠久藏不壞，反之則不易久藏，認(rèn)為是因其中含有抑菌成分的緣故，而且這種抑菌成分極有可能是在浸米發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，并伴隨著發(fā)酵最后進(jìn)入成品黃酒中[4]。

黃酒浸米水中大量的微生物和豐富的發(fā)酵產(chǎn)物是保障黃酒發(fā)酵在開放條件下正常和順利進(jìn)行的關(guān)鍵因素之一[5]。張鳳杰等[6]對(duì)黃酒浸米水中的細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定，并分析代表菌株的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)酸能力和酸味特性。欒同青等[7]應(yīng)用變性梯度凝膠電泳（denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）技術(shù)對(duì)黃酒浸米水中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析研究。而發(fā)酵過程中浸米水中的微生物和物質(zhì)的變化機(jī)理和涉及的具體物質(zhì)目前并未有深入的研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，浸米水中都存有抑菌物質(zhì)[5]，本研究以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為指示菌[8]，對(duì)黃酒浸米水中的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了分離純化和鑒定，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行鑒定，并測(cè)定抑菌物質(zhì)抑菌活性[9]，為黃酒浸米水的抑菌活性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：江南大學(xué)生物工程學(xué)院微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室；浸米水：浙江塔牌紹興酒有限公司。

磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、甲醇（色譜純）、三氟乙酸（色譜純）、氫氧化鈉（色譜純）、乙醇（色譜純）、乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品（nisin）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1200高效液相色譜儀、Agilent Extend-C18柱（150 mm×4.6 mm，2.5 μm）：美國(guó)安捷倫科技有限公司；SephadexG-25層析柱（180 mm×60 mm，250 μm）：上海寶曼生物科技有限公司；AKTA Avant蛋白純化分離系統(tǒng)：通用電氣醫(yī)療集團(tuán)；3K-15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司；HARE-52A旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器：北京恒奧德儀器儀表有限公司；ALPHA 1-2 LD plus真空冷凍干燥機(jī)：上海艾測(cè)電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[10]：準(zhǔn)確稱取蛋白胨15.0 g、氯化鈉5.0 g、牛肉膏3.0 g、蒸餾水977.0 g，調(diào)節(jié)pH至7.2；

指示菌培養(yǎng)基[11]：準(zhǔn)確稱取蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、酵母提取物5.0 g、瓊脂條15.0 g、蒸餾水950.0 g；

將金黃色葡萄球菌用接種針挑取少量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，混合均勻后于搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床速度200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間24 h。

1.3.2 藥敏片法繪制乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]

取0.5 mL濃度為1.0×1010CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液均勻涂布于指示劑培養(yǎng)基上。分別準(zhǔn)確稱取11.80 mg、9.44 mg、7.08 mg、4.72 mg、2.36 mg的乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶于0.02 mol/L的鹽酸溶液配制成100%、80%、60%、40%、20%的飽和乳酸鏈球菌素溶液（pH值為2.0），并用空白紙片制成不同濃度的藥敏片，分別將藥敏片放置在上述的指示劑培養(yǎng)基上于37 ℃培養(yǎng)12 h，記錄抑菌圈大小，制作乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 浸米水中抑菌物質(zhì)粗提樣品的制備[13]

取500 mL工業(yè)化黃酒生產(chǎn)過程中的浸米水，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮處理，制得10倍浸米水濃縮液。取10倍濃縮浸米水離心除去沉淀，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，時(shí)間20 min。取上清調(diào)節(jié)pH值至9.0，室溫放置20 min。收集絮狀沉淀，溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 2.3），過濾，取上清液，再用堿液將pH值調(diào)節(jié)至9.0，收集沉淀，溶于無菌水，用酸液調(diào)節(jié)pH值至2.0，出現(xiàn)沉淀后過濾除沉淀，上清液即為抑菌粗提物。

1.3.4 浸米水中抑菌粗提物的純化

SephadexG-25凝膠層析[14]：利用凝膠柱G-25進(jìn)行分離純化，上樣量為2 mL抑菌粗提物，收集不同純化時(shí)間所出現(xiàn)的洗脫峰的洗脫溶液。每2 min收集一管，每管收集4 mL，流速設(shè)定為2 mL/min，用去離子水進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為280 nm，以洗脫時(shí)間所對(duì)應(yīng)的收集管管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。由于吸光度值的大小與洗脫液中蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，因此根據(jù)記錄儀顯示吸光度值和相應(yīng)峰值時(shí)間，進(jìn)而找出洗脫液含有較多的蛋白質(zhì)類物質(zhì)的收集管。

冷凍干燥[15]：將洗脫峰收集管液合并置于-18 ℃冰箱冷凍24 h，完全凍結(jié)后開蓋包扎留小孔放入真空冷凍干燥機(jī)凍干36 h，直至管內(nèi)只留下粉末狀物質(zhì)，溶于2 mL無菌水，備用。

1.3.5 浸米水抑菌活性的測(cè)定[16]

采用藥敏試驗(yàn)對(duì)分離純化的物質(zhì)抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)所用的藥敏片是由自動(dòng)收集管濃縮液和無菌濾紙制得；利用直徑為1 cm的打孔機(jī)對(duì)無菌濾紙打孔，將制得的無菌紙片浸泡在無菌蒸餾水中制得空白紙片，將無菌紙片浸泡在自動(dòng)收集管濃縮液里即制得抗菌紙片。

取0.5 mL菌濃為1.0×1010CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液，均勻涂布于指示劑培養(yǎng)基上，待平板上看不到明顯溶液，取藥敏片均勻放置在平板上。倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，根據(jù)抑菌圈確定抑菌物質(zhì)所在的收集管管號(hào)。

1.3.6 高效液相色譜法分析鑒定浸米水抑菌物質(zhì)

將經(jīng)過藥敏試驗(yàn)篩選的具有抑菌活性樣品與乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品分別用高效液相色譜測(cè)定。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速1 mL/min，流動(dòng)相0.01 mol/L磷酸氫二鉀∶甲醇（75∶25，V∶V）[17]，色譜柱為Agilent Extend-C18柱（150 mm×4.6 mm，2.5 μm），進(jìn)樣量為20 μL，梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鏈球菌素藥敏片法測(cè)定抑菌圈直徑繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以質(zhì)量濃度為11.80 mg/mL、9.44 mg/mL、7.08 mg/mL、4.72 mg/mL、2.36 mg/mL乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液制配成100%、80%、60%、40%、20%的藥敏片分別編號(hào)為1～5，測(cè)定其抑菌圈直徑，結(jié)果見圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌上不同濃度乳酸鏈球菌素抑菌圈Fig.1 Inhibition zone of different concentrations of nisin on Staphylococcus aureus

從圖1可見，1～5號(hào)抑菌圈直徑分別為16.3mm、15.7mm、15.1 mm、14.2 mm和13.2 mm。以乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，抑菌圈直徑（y）為橫坐標(biāo)，繪制乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of nisin

由圖2可知，抑菌圈直徑隨著乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的增加而增加，乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.038 5x+12.59，相關(guān)系數(shù)R2為0.992 41，表明二者線性關(guān)系良好。

2.2 10倍濃縮浸米水對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

取0.5 mL菌濃為1.0×1010CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液，均勻涂布于指示劑培養(yǎng)基上。取3張直徑均為1 cm空白紙片用適量10倍濃縮浸米水制成抗菌紙片，待平板上看不到明顯溶液，取藥敏片均勻放置在平板上，倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，結(jié)果見圖3。

圖3 濃縮浸米水抑菌圈Fig.3 Inhibition zone of condensed rice steeping water

由圖3可知，10倍濃縮浸米水對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用，測(cè)量其抑菌圈直徑大小分別為13.3 mm、13.5 mm、12.8 mm，平均值為13.2 mm，說明10倍濃縮浸米水含有抑制金黃色葡萄球菌的物質(zhì)。

2.3 SephadexG-25凝膠層析分離純化浸米水中的抑菌物質(zhì)

利用凝膠柱G-25對(duì)浸米水中抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化，以洗脫時(shí)間所對(duì)應(yīng)的收集管管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線見圖4。

圖4 浸米水SephadexG-25凝膠層析柱洗脫曲線Fig.4 Elution curve of rice steeping water on SephadexG-25 gel column chromatography

如圖4可以看出，浸米水中抑菌物質(zhì)的粗提樣品經(jīng)SepHadexG-25凝膠層析后出現(xiàn)3個(gè)明顯洗脫峰，取各峰最近的兩個(gè)自動(dòng)收集管，即8、9、16、17、27、28管重新標(biāo)記為管1至6，制作管1～6的藥敏片進(jìn)行藥敏片法抑菌試驗(yàn)。

2.4 洗脫組分對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

取1～6號(hào)藥敏片均勻放置在金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基上根據(jù)抑菌圈確定抑菌物質(zhì)所在的收集管管號(hào)。結(jié)果見圖5。

圖5 浸米水洗脫組分的抑菌圈Fig.5 Inhibition zone of elution fractions of rice steeping water

由圖5可知，1號(hào)管相比其他5管有明顯抑菌圈，經(jīng)測(cè)量1號(hào)管抑菌圈直徑大小為12.3 mm，說明經(jīng)純化、洗脫和收集的物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌仍然具有抑制作用。

2.5 高效液相色譜鑒定抑菌物質(zhì)成分

將經(jīng)過藥敏試驗(yàn)篩選的具有抑菌活性樣品與乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品分別用高效液相色譜測(cè)定，結(jié)果見圖6。

圖6 浸米水(A)、洗脫組分(B)及乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品(C)的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of soak rice water (A),elution fractions(B) and nisin standard (C)

由圖6可知，浸米水、洗脫液與乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜檢測(cè)出峰時(shí)間分別是1.081 min、1.080 min和1.083 min，三者基本完全一致，因此，確定浸米水、洗脫液中抑菌物質(zhì)為乳酸鏈球菌素。

3 結(jié)論

本研究對(duì)黃酒浸米水中分離得到的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化和鑒定，最終確定黃酒浸米水中的抑菌物質(zhì)為乳酸鏈球菌素，是自然產(chǎn)生的天然防腐劑。這為傳統(tǒng)紹興酒工藝中冬天長(zhǎng)時(shí)間浸米的科學(xué)性、必要性和傳統(tǒng)紹興黃酒釀造的順利進(jìn)行及能夠長(zhǎng)期儲(chǔ)存的安全性提供了理論依據(jù)。

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