熱帶醋酸桿菌B104發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

朱運平，李大為，張 雪，黃月宜，李秀婷 *，梁治軍，孫寶國

（1.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京工商大學(xué)，北京 100048；2.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心 北京工商大學(xué)，北京 100048；3.食品質(zhì)量與安全北京實驗室 北京工商大學(xué)，北京 100048；4.河南省淼雨飲品股份有限公司，河南 焦作 454191）

果醋被譽為“21世紀(jì)的食品”，愈來愈受到人們的重視[1-3]。與傳統(tǒng)的糧食醋相比，果醋的果味突出、香氣襲人、兼具水果和食醋的營養(yǎng)保健功能。研究發(fā)現(xiàn)，果醋中含有多種必需氨基酸、有機酸以及各種維生素等，具有提高機體免疫力、防癌抗癌等作用[4-5]。目前果醋產(chǎn)品在發(fā)達國家市場已經(jīng)相當(dāng)普遍，而在我國由于果醋生產(chǎn)技術(shù)的相對落后、品種的相對單一、專用菌種的缺少、現(xiàn)有菌種的產(chǎn)酸能力有待提高等問題，尚未形成完善的果醋市場。

果醋發(fā)酵和良好風(fēng)味的形成離不開醋酸菌菌種，我國在醋酸菌菌種的選育和應(yīng)用方面進行了大量的研究[6-7]。目前我國果醋加工常用的菌種仍為惡臭醋酸桿菌（Acetobacter rancens）As1.41和滬釀1.01[8-13]。菌種的篩選主要集中于具有耐高溫、高酒精等特性的菌株[14-16]。另外，純培養(yǎng)的醋酸菌容易變形死亡，培養(yǎng)菌種的篩選、優(yōu)化等直接關(guān)系到發(fā)酵的成功與否。所以，對菌株發(fā)酵條件優(yōu)化是必要的。目前尚未見熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）用于果醋制備的研究報道較少。僅有為數(shù)不多的幾篇文獻報道了熱帶醋酸桿菌在其他領(lǐng)域的應(yīng)用。如任播楊[17]的研究表明，熱帶醋酸桿菌能夠改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)條件，促進羅非魚的生長，是提高羅非魚腸道消化酶活性和血清非特異性免疫活性的微生態(tài)制劑。SOEMPHOL W等[18-19]的研究表明，熱帶醋酸桿菌SKU1100具有很好的耐熱性能，甚至可以在42 ℃以上的條件中生長，還可以誘變產(chǎn)多糖缺陷菌株產(chǎn)生一種由半乳糖、葡萄糖和鼠李糖組成的薄皮多糖，并依附在細胞的表面上。

本研究從自然發(fā)酵的蘋果醋醪中篩選鑒定得到1株性能與惡臭醋酸桿菌（Acetobacter rancens）As1.41相當(dāng)?shù)臒釒Т姿釛U菌（Acetobacter tropicalis）B104，并以菌株產(chǎn)酸量為評價指標(biāo)，分別從發(fā)酵方式、接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值、碳源、氮源等因素對熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）B104的發(fā)酵培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化，為熱帶醋酸桿菌B104在果醋加工和應(yīng)用方面提供有力的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）B104：本實驗室從自然發(fā)酵的蘋果醋醪中篩選鑒定得到。

1.1.2 試劑

無水乙醇、氫氧化鈉（NaOH）：北京化工廠；葡萄糖：西隴化工股份有限公司；丙三醇、鹽酸（HCl）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母膏、瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g，酵母膏0.5 g，瓊脂2.0 g，丙三醇2.5 mL，水100 mL，121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻后加入體積分?jǐn)?shù)為3%的無水乙醇。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g，酵母膏1.0 g，pH值為5.5，水100 mL，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

JY2002電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3CpH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DL-CJ-2ND I超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；YQX-SG46-280S高壓蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TENSUC恒溫搖床：上海天呈實驗儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熱帶醋酸桿菌B104的斜面培養(yǎng)及擴大培養(yǎng)

將熱帶醋酸桿菌B104的接種于斜面培養(yǎng)基，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。從斜面培養(yǎng)基上刮取熱帶醋酸桿菌B104菌落接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)12 d，按照4%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.3.2 發(fā)酵方式對菌株產(chǎn)酸量的影響

在溫度30 ℃，葡萄糖質(zhì)量濃度10.0 g/L，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)5.0%，酵母膏質(zhì)量濃度10.0 g/L，初始pH值為5.5，接種量4.0%條件下。搖瓶發(fā)酵采用裝液量50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速120 r/min，分別采用靜置培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)12 d，考察不同發(fā)酵方式對菌株產(chǎn)酸量的影響。

1.3.3 菌株產(chǎn)酸量的檢測方法及計算公式

菌株產(chǎn)酸量采用酸堿滴定法：取2 mL發(fā)酵液于三角瓶內(nèi)，加入50 mL蒸餾水，3～5滴0.5%酚酞酒精溶液，用標(biāo)定的0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴至淺粉紅色，由耗用的氫氧化鈉溶液體積計算樣品中的產(chǎn)酸量。每個菌株進行3個平行處理，取平均結(jié)果。產(chǎn)酸量計算公式：

產(chǎn)酸量（g/L）=（V-V0）×CNaOH×0.060×1 000

式中：V為發(fā)酵液樣品消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL；V0為以空白培養(yǎng)基為對照耗用的氫氧化鈉溶液體積，mL；CNaOH為氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；0.060為醋酸分子的折算系數(shù)。

1.3.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

（1）接種量對菌株產(chǎn)酸量的影響

采用搖瓶培養(yǎng)方式，接種量分別為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%，其他培養(yǎng)條件不變，發(fā)酵12 d，考察接種量對菌株產(chǎn)酸量的影響。

（2）培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸量的影響

采用搖瓶培養(yǎng)方式，培養(yǎng)溫度分別為28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃，其他培養(yǎng)條件不變，發(fā)酵12 d，考察培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸量的影響。

（3）搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酸量的影響

轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，其他培養(yǎng)條件不變，發(fā)酵12 d，考察搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酸量的影響。

（4）初始pH值對菌株產(chǎn)酸量的影響

用1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，其他培養(yǎng)條件不變，發(fā)酵12 d，考察初始pH值對菌株產(chǎn)酸量的影響。

1.3.5 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

（1）碳源對菌株產(chǎn)酸量的影響

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖及無水乙醇作為最適碳源。葡萄糖質(zhì)量濃度分別為0、10.0 g/L、30.0 g/L、50.0 g/L、70.0 g/L、90.0 g/L。無水乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下發(fā)酵12 d，考察葡萄糖及無水乙醇添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響。

（2）氮源對菌株產(chǎn)酸量的影響

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇酵母膏作為最適氮源。酵母膏質(zhì)量濃度分別為5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L、30.0 g/L，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下發(fā)酵12 d，考察酵母膏添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵方式對菌株產(chǎn)酸量的影響

通過靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)來研究不同發(fā)酵方式對菌株產(chǎn)酸量的影響。發(fā)酵方式對菌株產(chǎn)酸量的影響結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在發(fā)酵過程中，氧氣作為醋酸菌氧化乙醇為醋酸的底物，攪拌可增加培養(yǎng)基中的溶氧，所以攪拌有利于醋酸桿菌產(chǎn)酸反應(yīng)的進行。熱帶醋酸桿菌B104在靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)下的第12天產(chǎn)酸量達到最大，產(chǎn)酸量分別為28.1 g/L和36.2 g/L。結(jié)果表明，搖床培養(yǎng)條件下熱帶醋酸桿菌B104產(chǎn)酸量明顯高于靜置培養(yǎng)，因此以下實驗均采取搖床發(fā)酵12 d的方式進行。

圖1 發(fā)酵方式對熱帶醋酸桿菌B104產(chǎn)酸量的影響Fig.1 Effect of fermentation mode on acid production by Acetobacter tropicalis B104

2.1.2 接種量對菌株產(chǎn)酸量的影響

當(dāng)菌體接種量適量時，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量與菌體接種量是正比關(guān)系；但當(dāng)菌體接種量過大時，營養(yǎng)物質(zhì)過快消耗，有毒物質(zhì)迅速積累，培養(yǎng)液營養(yǎng)成分發(fā)生明顯改變等都會對發(fā)酵過程產(chǎn)生很大影響。接種量對菌株產(chǎn)酸量的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 接種量對熱帶醋酸桿菌B104產(chǎn)酸量的影響Fig.2 Effect of inoculum on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由圖2可知，當(dāng)菌體接種量＜4.0%時，菌株的產(chǎn)酸量隨著接種量的增加而升高，在接種量為4.0%時，產(chǎn)酸量達到最大值39.7 g/L，隨著接種量的增加，菌株的產(chǎn)酸量呈現(xiàn)下降趨勢。所以熱帶醋酸桿菌B104的最佳接種量為4.0%。王玉冰等[16]研究表明，接種量不同對醋酸菌的產(chǎn)酸結(jié)果有不同的影響，接種量過小，菌體生長緩慢，延長了發(fā)酵的周期，使生產(chǎn)效率降低；接種量過大，菌體生長旺盛，因此大量的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，導(dǎo)致菌體過早衰老死亡，降低了原料的轉(zhuǎn)化率。

2.1.3 搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酸量的影響

菌株生長需要適合氧氣，當(dāng)溶氧速率大于菌體的耗氧速時，菌體能正常生長，否則菌體生長緩慢或不生長。搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酸量的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 轉(zhuǎn)速對熱帶醋酸桿菌B104產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of rotation speed on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由圖3可知，搖床轉(zhuǎn)速為100～120 r/min時，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，菌株的產(chǎn)酸量呈增加趨勢，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為120～200 r/min時，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，菌株的產(chǎn)酸量緩慢下降。搖床轉(zhuǎn)速120 r/min時熱帶醋酸桿菌B104的產(chǎn)酸量最大，為40.1 g/L。宋勇強等[20]研究表明，當(dāng)?shù)竭_發(fā)酵最適轉(zhuǎn)速時，即達到了溶解氧的供需平衡，此時發(fā)酵液中的溶氧可以滿足菌體的生長需求，高或低都會影響菌體生長和產(chǎn)酸。

2.1.4 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸量的影響

溫度是微生物生長的重要環(huán)境條件之一。任何微生物只能在一定的溫度范圍內(nèi)生存，在適宜的范圍內(nèi)大量繁殖。培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 培養(yǎng)溫度對熱帶醋酸桿菌B104產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of cultivation temperature on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度較低的時候，菌株的產(chǎn)酸量也較低，隨著溫度的升高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時，菌株的產(chǎn)酸量最高，為44.2 g/L。當(dāng)培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，菌株的產(chǎn)酸量卻呈現(xiàn)下降趨勢。所以熱帶醋酸桿菌B104最適培養(yǎng)溫度為30 ℃。姜曉芝等[21]研究表明，影響醋酸菌生長繁殖最重要的因素之一就是培養(yǎng)溫度。在一定溫度范圍內(nèi)，菌體的生長繁殖和代謝活動會隨著溫度的升高而加強。當(dāng)溫度上升到一定程度，開始對菌體產(chǎn)生不利的影響，若繼續(xù)升高溫度，高溫會使菌體細胞的核酸變性、細胞膜溶解、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，使菌體的細胞功能急劇下降以至死亡。

2.1.5 初始pH對菌株產(chǎn)酸量的影響

培養(yǎng)基pH值對微生物酶系的組成、結(jié)構(gòu)以及酶解過程都會產(chǎn)生明顯的影響，從而影響菌株的產(chǎn)酸量。培養(yǎng)基初始pH對熱帶醋酸桿菌產(chǎn)酸量的影響結(jié)果見圖5所示。

圖5 初始pH對熱帶醋酸桿菌B104產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effect of initial pH on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由圖5可知，在初始pH值為4.0時菌株的產(chǎn)酸能力較低，隨著pH值的升高，菌株的產(chǎn)酸量增加，在pH值為5.5時產(chǎn)酸量達到最高，為45.1 g/L，隨著pH值的再升高，菌株的產(chǎn)酸量逐漸降低。所以在發(fā)酵產(chǎn)酸過程中，熱帶醋酸桿菌B104最佳初始pH值為5.5。宋勇強等[20]研究表明，初始pH的變化，會使發(fā)酵液的醋酸含量呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。初始pH過高或過低都不利于菌株生長繁殖和產(chǎn)酸。

2.2 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 碳源（葡萄糖、乙醇）添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

葡萄糖、無水乙醇的添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響結(jié)果如圖6所示。

由圖6A可知，當(dāng)葡萄糖的質(zhì)量濃度＜10.0 g/L時，隨著葡萄糖濃度的升高，菌株的產(chǎn)酸量增加，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度達到10.0 g/L時，菌株的產(chǎn)酸量最大，為52.1 g/L，之后隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的提高，菌株的產(chǎn)酸量卻呈現(xiàn)了下降趨勢。所以在醋酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸過程中，10.0 g/L葡萄糖添加量最利于熱帶醋酸桿菌B104的生長繁殖和產(chǎn)酸。易九龍等[21]研究表明，在無葡萄糖時，醋酸菌主要以乙醇為碳源進行生長繁殖及產(chǎn)酸代謝，但產(chǎn)酸量較低。隨著葡萄糖濃度的升高，菌株的產(chǎn)酸量增加，但當(dāng)葡萄糖濃度過高時會使菌體細胞的滲透壓升高，不利于其生長代謝，從而影響菌株發(fā)酵產(chǎn)酸能力。由圖6B可知，當(dāng)無水乙醇的添加量為5.0%時，菌株的產(chǎn)酸量達到最高53.1 g/L，無水乙醇添加量＜5.0%的范圍內(nèi)，菌株的產(chǎn)酸量隨著無水乙醇添加量的增大而增加，無水乙醇添加量＞5.0%時，菌株的產(chǎn)酸量隨著添加量的不斷增加而逐漸降低。所以在醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸過程中，熱帶醋酸桿菌B104的最佳無水乙醇添加量為5.0%。姜曉芝等[22]研究表明，當(dāng)無水乙醇添加量過高時，菌體過度繁殖，使得大部分菌體細胞迅速衰老，從而影響醋酸菌的產(chǎn)酸量。

圖6 葡萄糖(A)及無水乙醇(B)添加量對熱帶醋酸桿菌B104產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effect of glucose(A)and ethanol(B)addition on acid production by Acetobacter tropicalis B104

2.2.2 酵母膏添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

酵母膏的添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響結(jié)果如圖7所示。

圖7 氮源添加量對熱帶醋酸桿菌B104產(chǎn)酸量的影響Fig.7 Effect of nitrogen source concentration on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由圖7可知，當(dāng)酵母膏的質(zhì)量濃度為20.0 g/L時菌株的產(chǎn)酸量達到最高水平，為55.4 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度＜20.0 g/L的范圍內(nèi)，菌株的產(chǎn)酸量隨著酵母膏濃度的增大而增加，酵母膏質(zhì)量濃度＞20.0 g/L，菌株的產(chǎn)酸量隨著質(zhì)量濃度的不斷增加而逐漸降低。所以在醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸過程中，熱帶醋酸桿菌B104的最佳酵母膏添加量為20.0 g/L。

3 結(jié)論

本研究從實驗室自然發(fā)酵的蘋果醋醪中篩選鑒定得到1株性能較為優(yōu)良的熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）B104，并對該菌株生長繁殖的最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成為接種量為4.0%，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)基初始pH 5.5，10.0 g/L葡萄糖和體積分?jǐn)?shù)為5.0%的無水乙醇為碳源，20.0 g/L酵母膏為氮源。在此條件下培養(yǎng)12 d，該株菌的產(chǎn)酸量可以達到55.4 g/L，是優(yōu)化前的1.5倍。通過優(yōu)化該菌株發(fā)酵工藝參數(shù)，提高了該菌株的產(chǎn)酸能力，為其在果醋制備中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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