產(chǎn)D-乳酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵工藝研究

韓文靜，梁穎超，陶 進，張廣昊

(玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春 130033)

乳酸又稱丙醇酸，是自然界最小的手性分子，具有L(+)和D(-)2種光學構型[1-3]。D-乳酸作為手性中心，是合成多種手性物質(zhì)的前體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等方面應用十分廣泛。2000年以后，世界乳酸總生產(chǎn)能力已超過25萬t/a，總產(chǎn)量為13萬t/a，并每年遞增[4]。D-乳酸的年生產(chǎn)量約1.6萬t，而發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸的需求量約2.6萬t[5]，所以D-乳酸的研究擁有廣闊的市場前景。例如德國巴斯夫公司生產(chǎn)的S-2-氯丙酸除草劑、日本達意賽爾生產(chǎn)的對乙基苯氧丙酸除草劑、德國赫斯特公司生產(chǎn)的威霸除草劑[4]等。此外，D-乳酸還可用于聚乳酸的生產(chǎn)，根據(jù)生產(chǎn)的聚乳酸的性質(zhì)，可以應用于各類食品和化妝品的外包裝材料，在服裝方面也有很好的應用前景，可以做成紗、編織物等。

世界乳酸產(chǎn)量的90%是通過發(fā)酵法生產(chǎn)的，其余是化學合成的。國際上的D-乳酸生產(chǎn)也主要采用微生物發(fā)酵法[6]。我國的D-乳酸生產(chǎn)量遠遠不能滿足工業(yè)需要，生產(chǎn)技術相對落后，尤其對D-乳酸生產(chǎn)菌研究相對落后[7]。因此，對D-乳酸產(chǎn)生菌研究是非常重要的。關于研究發(fā)酵法產(chǎn)D-乳酸的工作有一些報道，王剛等[8]對假腸膜明串珠菌進行研究，得出該菌的最適生長溫度為35 ℃，最適pH為6.5，4%初始葡萄糖濃度，6%的接種量，35 ℃有助于發(fā)酵產(chǎn)酸，35 ℃耗糖速度最快。劉海燕等[9]以麥芽汁為培養(yǎng)基發(fā)酵德氏乳桿菌RFXI，通過優(yōu)化培養(yǎng)基，使RFXI的活菌數(shù)比優(yōu)化前提高了4.6倍。劉聯(lián)杰[10]對誘變后的菊糖芽孢乳桿菌進行研究，得到發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖152.90 g/L，蛋白胨18.25 g/L，牛肉膏10.00 g/L，酵母抽提物6.25 g/L，磷酸氫二鉀3.00 g/L，乙酸鈉3.00 g/L，七水硫酸鎂0.10 g/L。許婷婷等[11]對誘變后的乳桿菌進行研究，得到該菌株在只含葡萄糖及無機鹽的培養(yǎng)基中對糖的總轉化率接近理論最大值，達到98%，D-乳酸產(chǎn)量達到48.5 g/L，光學純度在99%以上。于培星[12]以凝結芽孢桿菌JD-063D為出發(fā)菌株，通過誘變后篩選出一株JD-76D，產(chǎn)酸由出發(fā)菌株的61 g/L提高到145 g/L，D-乳酸純度由原菌株的97.5%增加到98.7%以上。目前鮮見關于德氏乳桿菌保加利亞亞種生長的研究報道。筆者分析了德氏乳桿菌保加利亞亞種在不同條件下的生長情況，從而篩選出適合其生長的環(huán)境，為德氏乳桿菌保加利亞亞種產(chǎn)D-乳酸條件摸索及生產(chǎn)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。德氏乳桿菌保加利亞亞種，由吉林農(nóng)業(yè)大學提供，玉米深加工國家工程研究中心活化保藏。

1.1.2培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基：蛋白胨1.000%，牛肉粉0.800%，酵母粉0.400%，葡萄糖2.000%，磷酸氫二鉀0.200%，檸檬酸氫二銨0.200%，乙酸鈉0.500%，硫酸鎂0.020%，硫酸錳0.004%，瓊脂1.400%，吐溫-80 0.100%，118 ℃滅菌15 min，pH 6.3～6.7。種子培養(yǎng)基(MRS肉湯培養(yǎng)基)：蛋白胨1.000%，牛肉粉0.800%，酵母粉0.400%，葡萄糖2.000%，磷酸氫二鉀0.200%，檸檬酸氫二銨0.200%，乙酸鈉0.500%，硫酸鎂0.020%，硫酸錳0.004%，吐溫-80 0.100%，118 ℃滅菌15 min，pH 5.5～5.9。 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1.000%，牛肉粉0.800%，酵母粉0.400%，葡萄糖7.000%，磷酸氫二鉀0.200%，檸檬酸氫二銨0.200%，乙酸鈉0.500%，硫酸鎂0.020%，硫酸錳0.004%，吐溫-80 0.100%，發(fā)酵前一次性加入碳酸鈣5.000%，118 ℃滅菌15 min，pH 6.4～6.7。

1.2方法

1.2.1產(chǎn)酸量檢測。采用EDTA定鈣法，按照文獻[13-14]方法進行。

1.2.2不同葡萄糖添加量對產(chǎn)酸量的影響。葡萄糖添加量為2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，通過EDTA定鈣法測定不同葡萄糖濃度的發(fā)酵液中產(chǎn)酸量。

1.2.3不同初始pH對菌體生長的影響。菌種分別接種在pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%。采用分光光度法在600 nm波長下測定OD值。

1.2.4不同溫度對產(chǎn)酸量的影響。培養(yǎng)溫度是細菌生長的一個重要因素，它可以通過改變脂肪酸的組成影響細胞膜和細胞壁結構的組成及其完整[15]。根據(jù)文獻記載，德氏乳桿菌保加利亞亞種生長溫度為37～45 ℃，當溫度高于50 ℃或低于20 ℃時菌體不能生長[16]。在其他發(fā)酵條件為最佳狀態(tài)下，選擇生長溫度分別為36、38、40、42、44、46 ℃，采用EDTA法測定上述溫度下的產(chǎn)酸量。

1.2.5不同接種量對產(chǎn)酸量的影響。接種量大小影響菌體生長速度。過小，會延長菌種生長的遲緩期，發(fā)酵周期變長；過大，會使菌體生長過剩，菌體利用營養(yǎng)物質(zhì)自身生長，不利于產(chǎn)酸。在最佳發(fā)酵溫度、pH、裝液量條件下，接種量分別為6%、8%、10%和12%，測定產(chǎn)酸量，確定最佳接種量。

1.2.6不同裝液量對產(chǎn)酸量的影響。裝液量的多少影響發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧值的大小，該試驗使用的菌種是兼性厭氧型，溶氧值的大小直接影響產(chǎn)酸量。在其他發(fā)酵條件為最佳狀態(tài)下，裝液量分別為50、75、100、125、150 mL，測定不同裝液量下的產(chǎn)酸量。

1.2.7發(fā)酵周期對產(chǎn)酸量的影響。發(fā)酵周期過短，菌體的生長不穩(wěn)定，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)主要提供給菌體生長，用于產(chǎn)物積累較少；而發(fā)酵周期過長，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和代謝產(chǎn)物的大量積累使菌體自溶，因此發(fā)酵周期對菌體的產(chǎn)酸量有很大的影響。在其他發(fā)酵條件最佳狀態(tài)下，在發(fā)酵周期24、32、40、48、56、64、72、78 h的條件下，測定產(chǎn)酸量。

2 結果與分析

2.1不同葡萄糖添加量對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖1可知，隨著葡萄糖添加量的增加，產(chǎn)酸量也有明顯的增加，當葡萄糖添加量達7%時，產(chǎn)酸量最高；但隨葡萄糖添加量繼續(xù)增加，產(chǎn)酸量反而降低。故選擇7%為葡萄糖最佳添加量。

圖1 不同葡萄糖添加量對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.1 Effect of different glucose additions on D-lactic acid production

2.2不同初始pH對菌體生長的影響由圖2可知，當初始pH為6.5時，菌體生長狀態(tài)最佳，故發(fā)酵初始pH確定為6.5。

圖2 不同初始pH對菌體生長的影響Fig.2 Effect of different initial pH on cell growth

2.3不同溫度對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖3可知，隨著溫度的升高，菌體產(chǎn)酸量增加，當溫度達到42 ℃時產(chǎn)酸量最高，隨著溫度的不斷增加，菌體產(chǎn)酸量開始降低，溫度影響細胞內(nèi)酶活變化，溫度升高，細胞內(nèi)酶促反應加快，代謝和生長也相應加快；但當溫度過高時，生物活性物質(zhì)發(fā)生變性，細胞功能下降甚至死亡。故選擇42 ℃為最佳生長溫度。

圖3 不同溫度對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of different temperature on D-lactic acid production

2.4不同接種量對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖4可知，隨著接種量的增加，產(chǎn)酸量也不斷增加，當接種量為10%時，產(chǎn)酸量最大，而接種量繼續(xù)增加時，產(chǎn)酸量反而下降，可能接種量過大，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分主要用于菌株的生長，從而造成了產(chǎn)酸量的降低。故以接種量10%為最佳值。

圖4 不同接種量對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of different inoculum size on D-lactic acid production

2.5不同裝液量對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖5可知，125 mL為最佳裝液量。

圖5 不同裝液量對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effect of different liquid loading on D-lactic acid production

2.6不同發(fā)酵周期對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖6可知，在72 h內(nèi)，D-乳酸的產(chǎn)酸量隨著時間的增長而增加，而在72 h以后，D-乳酸的產(chǎn)酸量開始減少，故確定72 h為最佳發(fā)酵周期。

圖6 發(fā)酵周期對D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effect of fermentation period on D-lactic acid production

3 結論

通過試驗得到產(chǎn)D-乳酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵工藝條件為葡萄糖添加量7%，生長溫度42 ℃，發(fā)酵周期72 h，初始pH 6.5，接種量10%，裝液量125 mL/250 mL，此時產(chǎn)酸量最高，為37.8 g/L。

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