傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中產(chǎn)α-淀粉酶菌株的篩選

孫曉東，呂國(guó)忠 *，欒雨時(shí)，陳 嶸，趙志慧

（1.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116600）

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬以大豆為原料，經(jīng)過煮制、擠壓成塊、制曲、發(fā)酵而成。在制曲和發(fā)酵過程中，利用原料和環(huán)境中的微生物自然發(fā)酵，是微生物利用蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等大分子物質(zhì)分解成為小分子風(fēng)味物質(zhì)的復(fù)雜過程，使豆醬的pH和各種養(yǎng)分發(fā)生變化[1]。據(jù)報(bào)道，每100 g豆瓣醬中含蛋白質(zhì)10.7 g、脂肪9.0 g、糖類12.9 g、鈣9 g、磷165 ng、鐵7.9 ng、鉀456 ng、硫胺素0.06 ng、核黃素0.24 g、煙酸1.5 ng[2-3]。此外，豆醬作為傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，還具有一定的功能性。研究表明，豆醬具有預(yù)防肝癌、抑制血清膽固醇上升、抑制脂肪肝積蓄、去除放射性物質(zhì)、降血壓、抗氧化等功效[4]。豆醬生產(chǎn)包括固態(tài)制曲和液態(tài)發(fā)酵。制曲階段是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的重要保證，所用的菌種一般為霉菌。有學(xué)者分離得到的霉菌經(jīng)鑒定主要為黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、高大毛霉（Mucor mucedo）和醬油曲霉（Aspergillus sojae）等[5]。這些真菌能夠分泌較復(fù)雜的酶系，包括蛋白酶（中性、酸性及堿性）、谷氨酰胺酶、α-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等[6]。α-淀粉酶屬于內(nèi)切型淀粉酶，是可對(duì)支鏈淀粉、直鏈淀粉或其他α-1,4-葡聚糖分子內(nèi)部的α-l,4-糖苷鍵以隨機(jī)的方式進(jìn)行水解，生成長(zhǎng)度不等的直鏈和支鏈寡糖的一類酶的總稱[7]。α-淀粉酶的來源非常廣泛，包括動(dòng)物、植物和微生物，目前能夠滿足工業(yè)應(yīng)用需求的α-淀粉酶主要來源于細(xì)菌和絲狀真菌，其中由真菌產(chǎn)生的α-淀粉酶即稱為真菌α-淀粉酶[8]。由于真菌α-淀粉酶所特有的性質(zhì)（如反應(yīng)溫度溫和，作用pH偏中性等），使得真菌α-淀粉酶在實(shí)際應(yīng)用中主要集中在食品應(yīng)用領(lǐng)域。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)254份采自東北三省各地的家庭自制豆醬進(jìn)行分離，獲得純培養(yǎng)真菌菌株389份，通過形態(tài)學(xué)分類[9-12]，明確了各菌株的分類地位。對(duì)這些菌株進(jìn)行了α-淀粉酶活性的篩選，通過可溶性淀粉平板初篩、發(fā)酵復(fù)篩等獲得高產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，并對(duì)其活性進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發(fā)酵豆醬：取自東北三省各地的農(nóng)戶家；試驗(yàn)主要化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

奧林帕斯CX21顯微鏡：日本奧林帕斯公司；2-16KL離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA2004型電子天平：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將保存于凍存管里的各供試菌株接入新鮮的PDA平板中，置25 ℃黑暗培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行菌株的初篩。

1.3.2 產(chǎn)α-淀粉酶菌株的初篩

采用可溶性淀粉培養(yǎng)基進(jìn)行菌株初篩[13]。在直徑9 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，注入15 mL可溶性淀粉培養(yǎng)基，待凝固成平板后，挑取單菌落接種于平板上，置25 ℃黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d，待菌落產(chǎn)孢后，在平板上滴加碘液，觀察菌落周圍有無(wú)透明圈出現(xiàn)，如形成了透明圈，說明該菌株產(chǎn)生α-淀粉酶，將淀粉分解。將產(chǎn)生透明圈的菌株進(jìn)行復(fù)篩發(fā)酵。

1.3.3 發(fā)酵復(fù)篩

取煮熟的大豆20 g，置于150 mL三角瓶中，滅菌。將菌株制成濃度為1×106CFU/mL的菌懸液，取1 mL置于滅菌的大豆中，于25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d。

1.3.4 酶液的制備

將發(fā)酵15 d的大豆三角瓶從培養(yǎng)箱中取出，加入50 mL無(wú)菌的去離子水，分散均勻，30 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，靜置。濾液在4 200 r/min離心20 min，取上清液作為粗酶液測(cè)定。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 麥芽糖溶液的配制方法Table 1 Preparation methods of different concentration of maltose

采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定α-淀粉酶的活性[14]。取7支干凈的具塞刻度試管、編號(hào)，按表1加入試劑。搖勻，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20 mL。以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在波長(zhǎng)540 nm處比色測(cè)定光密度值。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6α-淀粉酶活性測(cè)定

將各樣品酶液按照表2中的操作順序進(jìn)行反應(yīng)，以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在波長(zhǎng)540 nm處比色測(cè)定光密度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出相應(yīng)的麥芽糖含量。

表2 α-淀粉酶活性測(cè)定Table 2 Determination of α-amylase activity

酶活定義：在55 ℃、pH為5.6的條件下，以單位質(zhì)量樣品在單位時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。每個(gè)樣品做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值計(jì)算酶活力。

式中：U為α-淀粉酶活力，mg/（g·min）；M為根據(jù)樣品的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的麥芽糖的含量，mg；N為酶液的稀釋倍數(shù)；L為淀粉酶原液總體積的倍數(shù)；G為樣品的質(zhì)量，g；5為反應(yīng)的時(shí)間，min。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)α-淀粉酶菌株的初篩結(jié)果

將分離自豆醬的389株真菌在可溶性淀粉平板上培養(yǎng)，其中共有34株真菌在平板上滴加碘液時(shí)，菌落周圍形成了無(wú)色透明圈。說明該菌株產(chǎn)生α-淀粉酶將淀粉分解。這些類群包括曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）、犁頭霉（Absidia）、鐮孢菌（Fusarium）、木霉（Trichoderma）和帚霉屬（Scopulariopsis）。其中，曲霉（Aspergillus）和青霉（Penicillium）在種類和數(shù)量上都屬于優(yōu)勢(shì)種群。

2.2 3,5-二硝基水楊酸法測(cè)粗酶液活性結(jié)果

用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定發(fā)酵復(fù)篩后提取的粗酶液，各菌株都表現(xiàn)出了不同程度的α-淀粉酶活性，34株真菌的光密度值和酶活力及采集地見表3。

由表3可以看出，從豆醬上分離到的曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）、犁頭霉（Absidia）、鐮孢菌（Fusarium）、木霉（Trichoderma）和帚霉屬（Scopulariop-sis）的真菌都具有合成α-淀粉酶的能力，各菌株的產(chǎn)酶能力無(wú)太大的差異。其中曲霉屬和青霉屬的真菌數(shù)量和種類都占優(yōu)勢(shì)，是豆醬發(fā)酵過程中降解淀粉，產(chǎn)生α-淀粉酶的優(yōu)勢(shì)種群。

表3 各菌株的α-淀粉酶活性Table 3 α-amylase activity of the stains

3 結(jié)論

用可溶性淀粉平板對(duì)分離到的389株真菌進(jìn)行α-淀粉酶活性的初篩，得到了34株遇碘不變藍(lán)，產(chǎn)生透明圈的菌株。其中曲霉屬的真菌14株、青霉12株、毛霉2株、鐮孢菌2株、帚霉1株、犁頭霉1株、木霉2株。在曲霉屬中，米曲霉Aspergillus oryzae的數(shù)量最多，產(chǎn)酶能力穩(wěn)定，是曲霉屬中的優(yōu)勢(shì)種。而青霉屬中Penicillium aurantiogriseum和Penicillium verrucosum出現(xiàn)頻率較高，在撫順樣品中分離到的Penicillium aurantiogriseum表現(xiàn)出了較高的α-淀粉酶活性。Penicillium aurantiogriseum已用在了風(fēng)干香腸的制作中，用以提高香腸的風(fēng)味和質(zhì)地[15]。因此對(duì)分離到的Penicillium aurantiogriseum進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以期在豆醬的發(fā)酵過程中充分改善豆醬的品質(zhì)。

其他屬的真菌出現(xiàn)的頻率低，只有1株或者2株，但也具有或高或低的α-淀粉酶合成能力，如Absidia cylindrospora、Fusariumspp.、Trichoderma koningii等，α-淀粉酶的活性都保持在一個(gè)很高的水平。在豆醬的發(fā)酵中應(yīng)該是多菌株混合發(fā)酵，相互協(xié)同，共同將大豆中的碳水化合物降解。

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