神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)顆粒細(xì)胞增殖檢測(cè)方法的探討

于洋，柳春

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，遼寧 錦州121001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生化教研室，遼寧 沈陽(yáng)110032）

卵巢顆粒細(xì)胞（granulosa cell，GC）在生殖過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在動(dòng)物體內(nèi)，GC既可以營(yíng)養(yǎng)著卵母細(xì)胞，同時(shí)又能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。因此，顆粒細(xì)胞的增殖分泌功能與卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟有著非常密切的關(guān)系，兩者可以形成功能上的一個(gè)整體[1]。研究表明，在哺乳動(dòng)物的生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）的存在，提示NGF在生殖細(xì)胞的分化、發(fā)育和生理功能的維持方面具有重要的作用[2]。與胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)相似的5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU），能摻入到S期細(xì)胞的DNA合成過(guò)程中，摻入合成的程度越強(qiáng)，顯示細(xì)胞增殖的能力越強(qiáng)，另外還能避免以往應(yīng)用氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（thymidine，3H-TdR）檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的放射性損害[3]。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）中含有2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，經(jīng)活細(xì)胞線粒體脫氫酶還原后生成的黃色甲臜產(chǎn)物，具有高度水溶性，不需要有機(jī)溶劑裂解細(xì)胞就能夠直接進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟簡(jiǎn)便，靈敏度高，細(xì)胞毒性小。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證NGF的促生殖作用并探索其機(jī)制，同時(shí)建立一種更有效的卵巢GC體外培養(yǎng)的標(biāo)記方法，本研究采用分離和培養(yǎng)原代小鼠卵巢腔前顆粒細(xì)胞（preantral granulosa cells，PreGC），應(yīng)用CCK-8分析和BrdU體外標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞增殖，以探討NGF是如何影響GC的增殖。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

NGF，RD systems公司；DMEM-F12培養(yǎng)液，Tryple，胎牛血清，雙抗，GIBCO公司；BSA，Biotech BASIC INC公司；抗體，Promega公司；CCK-8，Dojindo laboratories公司；BrdU，BrdU in situ defection kitⅡ，BD Biosciences公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10 d齡的健康雌性ICR小白鼠，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（皖）2005-0008]。

1.3 PreGC的原代培養(yǎng)

小鼠斷頸處死后無(wú)菌取出雙側(cè)卵巢，去除周圍脂肪組織及卵巢被膜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗凈卵巢上血污，體視顯微鏡下用尖頭鑷子分離腔前卵泡，消化膜細(xì)胞5～10min后吸取單個(gè)腔前卵泡，2 000 r/min離心5min，棄上清液，加入胰酶消化15min，期間吹打數(shù)次，終止消化后離心5min，1 500 r/min，去上清，加入完全培養(yǎng)基制成顆粒細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，預(yù)接種到培養(yǎng)板中。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖

將細(xì)胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，設(shè)定NGF分別作用時(shí)間為12、24、48、72和96 h的實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)時(shí)間段都設(shè)定各自的對(duì)照組，對(duì)照組加入普通培養(yǎng)基，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。5%二氧化碳CO2，37℃孵箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁率達(dá)到90%，更換含0.1%BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓24 h，加入NGF使終濃度為50 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)各個(gè)時(shí)間段后終止培養(yǎng)，PBS清洗后每孔再加入10μl CCK-8溶液孵育12 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光值，計(jì)算平均值。

1.5 BrdU體外標(biāo)記GC增殖

將蓋玻片（1.5 cm×1.5 cm）在酒精燈上迅速過(guò)火后小心放入24孔培養(yǎng)板中，然后將單細(xì)胞懸液滴到玻片上，40μl/滴，然后加培養(yǎng)基到500μl，設(shè)定對(duì)照組和NGF組（50 ng/m l），每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，饑餓后加入NGF使終濃度為50 ng/ml繼續(xù)培養(yǎng)。

根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)36 h左右適時(shí)取出爬片，按照BrdU免疫熒光技術(shù)的步驟操作，Hoechst染核，封片后熒光顯微鏡拍照，隨即計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算標(biāo)記指數(shù)（labeling index，LI，百分?jǐn)?shù)表示）。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 NGF對(duì)小鼠卵巢PreGC促增殖作用

50 ng/m l的NGF作用PreGC不同時(shí)間段后，采用CCK-8法檢測(cè)NGF對(duì)細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果顯示，在波長(zhǎng)450 nm時(shí)，OD值隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)（12～96 h）而增加，當(dāng)NGF作用48 h時(shí)，促增殖作用明顯表現(xiàn)出來(lái)，同對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），隨著NGF作用時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，促增殖作用持續(xù)存在，同對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 BrdU的免疫熒光技術(shù)檢測(cè)及LI（%）

BrdU免疫熒光技術(shù)檢測(cè)顯示，經(jīng)50 ng/m l NGF處理36 h后，NGF對(duì)小鼠卵巢PreGC已經(jīng)有促增殖作用，見(jiàn)圖2。隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算LI（%），NGF組的BrdU的LI為45.03%，明顯高于對(duì)照組20.65%（P<0.01），見(jiàn)圖3。

圖1 不同孵育時(shí)間NGF對(duì)小鼠卵巢PreGC促增殖作用

圖2 NGF刺激小鼠卵巢PreGC 36 h后BrdU免疫熒光技術(shù)檢測(cè)結(jié)果 （×40）

圖3 NGF對(duì)BrdU陽(yáng)性PreGC標(biāo)記指數(shù)的影響

3 討論

顆粒細(xì)胞是卵巢的主要組成細(xì)胞，為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供其所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及生存的微環(huán)境[4]。卵母細(xì)胞通過(guò)縫隙連接從周圍的顆粒細(xì)胞中攝取各種營(yíng)養(yǎng)因子，使卵母細(xì)胞的代謝需要得以滿足。因此，顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)中起著重要的營(yíng)養(yǎng)作用[5]。而且，顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的縫隙連接是卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和成熟能夠正常進(jìn)行的必需因素；同時(shí)，卵母細(xì)胞對(duì)卵泡細(xì)胞功能起著中心調(diào)節(jié)作用[6]。卵母細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子對(duì)顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞的分化、增生、凋亡和泛素化起著廣泛的調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的關(guān)系是相互依賴的[7]。顆粒細(xì)胞的增殖和分化在原始卵泡形成啟動(dòng)以及以后的卵泡正常發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。因此，顆粒細(xì)胞是否能夠正常的增殖分化可作為卵泡發(fā)育成熟的標(biāo)志[8]。

最開(kāi)始的研究顯示：NGF的生物學(xué)功能僅僅限于神經(jīng)系統(tǒng)，但越來(lái)越多的證據(jù)表明NGF也可以作用于其他非神經(jīng)系統(tǒng)的組織細(xì)胞。研究表明，NGF及其受體TrkA和p75在動(dòng)物的生殖系統(tǒng)中有表達(dá)[9]。在豬卵巢中，NGF及其受體在膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中都有表達(dá)，從而證明NGF及其受體在卵泡發(fā)育、排卵等方面都有重要的作用[10]。在金倉(cāng)鼠的子宮組織中，NGF及其受體TrkA在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)，而p75只在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺細(xì)胞中有表達(dá)[11]。對(duì)山羊的研究顯示NGF及其受體TrkA與p75在輸卵管壺腹部與峽部的上皮細(xì)胞與肌細(xì)胞中有表達(dá)[12]。對(duì)小鼠和人的卵巢研究也表明，NGF的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致卵巢中初級(jí)卵泡與次級(jí)卵泡數(shù)量的大幅增加，而裸露的卵母細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少，表明不正常的NGF及其受體水平的增加會(huì)造成卵巢囊狀疾病[13]。

CCK-8試劑中含有WST-8，它是一種類似于MTT的化合物，在電子載體的作用下被細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。與傳統(tǒng)的MTT檢測(cè)法比較，CCK-8具有使用方便，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑，檢測(cè)快速，靈敏度高，甚至可以測(cè)定較低的細(xì)胞密度，重復(fù)性優(yōu)于MTT，對(duì)細(xì)胞毒性小等各種優(yōu)點(diǎn)[14]。

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8試劑盒比較了不同作用時(shí)間的NGF對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠PreGC增殖的影響，選取10 d齡的小鼠，獲取PreGC，避免分化的顆粒細(xì)胞自身因素對(duì)NGF促增殖作用的影響，并且在加入NGF前用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)，減少其他因素干擾細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)50 ng/ml的NGF作用顆粒細(xì)胞48 h的時(shí)候，促增殖作用非常明顯地表現(xiàn)出來(lái)，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，呈現(xiàn)一定的時(shí)效關(guān)系。雖然NGF對(duì)細(xì)胞的促增殖作用持續(xù)存在，但過(guò)長(zhǎng)的作用時(shí)間可能會(huì)使細(xì)胞的密度太大。因此，判定50 ng/ml的NGF對(duì)顆粒細(xì)胞的促增殖作用最理想反應(yīng)時(shí)間不能超過(guò)48 h。

BrdU作為胸腺嘧啶的類似物，能取代胸腺嘧啶被增殖細(xì)胞利用。當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期，即細(xì)胞處于增殖期，BrdU被細(xì)胞特異性地?cái)z入細(xì)胞核摻入到細(xì)胞新合成的DNA中，只要細(xì)胞存活，這種存留是永久的，用抗BrdU單克隆抗體經(jīng)免疫熒光技術(shù)染色后，可特異性顯示BrdU陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞，即可直接觀察其在細(xì)胞內(nèi)的摻入情況[15]。

本研究采用BrdU體外標(biāo)記方法，50 ng/m l的NGF作用顆粒細(xì)胞36 h后，進(jìn)行免疫熒光技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示熒光顯微鏡下可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性標(biāo)記的顆粒細(xì)胞，NGF組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，提示細(xì)胞處于增殖期。同時(shí)計(jì)算BrdU陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)LI（%），數(shù)據(jù)顯示NGF組的BrdU標(biāo)記指數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這更加直觀的表明NGF能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。

可見(jiàn)，在研究NGF促顆粒細(xì)胞增殖及影響因素實(shí)驗(yàn)中，采用CCK-8檢測(cè)和BrdU體外標(biāo)記的方法是可取的，它們是高效、便捷地標(biāo)記PreGC增殖的方法，而且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了NGF促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖是與時(shí)間呈時(shí)效關(guān)系的。

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