氯胺酮、人參皂苷Rg-1和氯化鋰逆轉(zhuǎn)電休克后抑郁大鼠認(rèn)知障礙的機(jī)制研究*

童珊珊，劉超

（1重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院 麻醉科，重慶402260；2天津市胸科醫(yī)院 麻醉科，天津300222）

電休克（electmconrulsive therapy，ECT）是在安全范圍內(nèi)讓電流通過大腦，通過引起意識(shí)喪失與電抽搐，是重度抑郁患者的首選治療。ECT時(shí)間超過120～180 s可造成認(rèn)知障礙，其原因與病理性的Glu信號(hào)系統(tǒng)功能異常有關(guān)，其可引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用（long-term potentiation，LTP）飽和狀態(tài)，造成突觸可塑性障礙，無法接收新的信息，導(dǎo)致認(rèn)知障礙。

Tau蛋白即低分子微管相關(guān)蛋白，分布于神經(jīng)元的軸突和樹突，為不對(duì)稱磷蛋白，促進(jìn)軸突微管的裝配和穩(wěn)定，保持微管間距離，影響神經(jīng)細(xì)胞軸突的物質(zhì)運(yùn)輸，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育，抑制脂質(zhì)過氧化，抑制微管蛋白聚集，與認(rèn)知密切相關(guān)。Tau蛋白磷酸化是調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能的主要手段，其被異常磷酸化后發(fā)生錯(cuò)誤折疊和分子聚集[1]，可削弱其穩(wěn)定微管的功能，造成遞質(zhì)運(yùn)輸、儲(chǔ)存和釋放障礙，導(dǎo)致認(rèn)知障礙[2]。

氯胺酮（ketamine hydrochloride）作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。興奮性氨基酸在腦缺氧、缺血時(shí)對(duì)神經(jīng)元的興奮性毒性作用是造成腦損傷的主要機(jī)制之一。氯胺酮可直接減少腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)的釋放[3]，從而減輕ECT導(dǎo)致的抑郁大鼠認(rèn)知障礙[4]。Rg-1是人參的主要成分之一，研究證明其有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用[5]，可易化認(rèn)知的獲得、鞏固和再現(xiàn)，但其透過血腦屏障的能力很弱。鋰可通過誘導(dǎo)GSK-3β在Ser9位點(diǎn)的磷酸化水平增加而發(fā)揮其對(duì)糖原合成 酶 激 酶-3β （glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的抑制作用[6]，進(jìn)而抑制細(xì)胞Tau蛋白磷酸化。

那么，ECT引起的Glu升高是否通過上調(diào)Tau蛋白的過度磷酸化而造成認(rèn)知障礙，以及氯胺酮、Rg-1或氯化鋰是否可以阻止這一過程成為研究焦點(diǎn)。本研究通過觀察氯胺酮、Rg-1和氯化鋰對(duì)ECT后嗅球切除抑郁模型大鼠認(rèn)知、海馬內(nèi)Glu濃度以及Tau蛋白過度磷酸化的影響，比較三者相關(guān)機(jī)制的異同。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 鹽酸氯胺酮純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（產(chǎn)品編號(hào)GBW09207，純度>99.5%，北京譜朋科技有限公司）；Rg-1單體（Rg-1，純度>98%，蕪湖甙而塔醫(yī)療科技有限公司）；氯化鋰（lithium，純度>97%，上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司）；純品L-谷氨酸（L-Glutamic acid，美國(guó)Sigma公司）；兔抗人p-AT8Ser202單克隆抗體（美國(guó)Gene Tex公司）；小鼠抗牛Tau5單克隆抗體（美國(guó)Millipore公司）；Harvard嚙齒類動(dòng)物ECT儀（美國(guó)自然基因有限公司）；莫瑞斯水迷宮（morris water maze，MWM）視頻分析系統(tǒng)（北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；HPLC色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；蛋白電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；金盤多媒體圖像處理系統(tǒng)（成都金盤電子科大多媒體技術(shù)有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 備選24周健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，體重250～300 g，由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，建立大鼠嗅球切除抑郁模型[7]：2.75%戊巴比妥鈉（55mg/kg，2ml/kg）腹腔注射，正中縫兩側(cè)旁開2mm距前囟前7～8mm處，鉆兩個(gè)直徑2mm孔，用探針破壞嗅球并吸出。青霉素（20萬u/ml）沖洗切口，連續(xù)3 d肌肉注射青霉素4萬u。2周后行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open field test）。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)又稱敞箱實(shí)驗(yàn)，是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新奇環(huán)境之中活躍行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時(shí)間評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抑郁程度的方法。單位時(shí)間內(nèi)動(dòng)物某一肢體越過的格子數(shù)為水平得分，后肢站立次數(shù)為垂直得分。測(cè)試均于上午9∶00開始，取曠場(chǎng)內(nèi)水平得分及垂直得分總和在30～120 s間的64只大鼠（此為評(píng)定為中度抑郁的實(shí)驗(yàn)大鼠，即造模成功的實(shí)驗(yàn)大鼠）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理原則》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和處理指南》。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組原則 采用隨機(jī)單位組析因設(shè)計(jì)分組原則：將每只大鼠視為1個(gè)單位，對(duì)每個(gè)單位予兩個(gè)處理因素，即ECT干預(yù)（2水平：無處置、1療程ECT）和藥物干預(yù)（4水平：海馬CA1區(qū)微量注射生理鹽水、氯胺酮、Rg-1和氯化鋰）的所有組合。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)措施 將造模成功的64只大鼠隨機(jī)分為8組（n=8）：I組（海馬CA1區(qū)微量注射1μl氯胺酮純品20μg+1個(gè)療程ECT）；II組（海馬CA1區(qū)微量注射1μl Rg-1 20μg+1個(gè)療程ECT）；III組（海馬CA1區(qū)微量注射1μl氯化鋰20μg+1個(gè)療程ECT）；IV組（海馬CA1區(qū)微量注射1μl生理鹽水+1個(gè)療程ECT）；V組（海馬CA1區(qū)微量注射1μl氯胺酮純品，20μg）；VI組（海馬CA1區(qū)微量注射1μl Rg-1 20μg）；VII組（海馬CA1區(qū)微量注射1μl氯化鋰20μg）；VIII組（海馬CA1區(qū)微量注射1μl生理鹽水）。

1.2.4 腦立體定位及海馬微量注射 大鼠麻醉后，以前囟點(diǎn)（Bregma）為坐標(biāo)原點(diǎn)，向海馬處（AP-3.8 mm，RL+/-2.5mm，V 2.5mm）植入一直徑0.9mm帶內(nèi)芯的不銹鋼套管，用磷酸水門汀固定，外層用牙托粉加固，實(shí)驗(yàn)中采用微量進(jìn)樣器通過埋植套管給注射藥品。

1.2.5 ECT處置 每次施行ECT前15min注射每組相應(yīng)藥物，于大鼠雙顳側(cè)安放電極，行ECT，予方波（單個(gè)正弦半波20ms，50 Hz），電流50mA，持續(xù)1 s，引起大鼠強(qiáng)直陣攣抽搐發(fā)作為成功，隔天1次，共7次，于9∶00 am開始。不施行ECT的組在同樣時(shí)間以同樣劑量注射相應(yīng)藥物。

1.2.6 MWM 視頻分析系統(tǒng)檢測(cè)大鼠的空間認(rèn)知

ECT療程結(jié)束24 h內(nèi)行MWM檢測(cè)。MWM內(nèi)水加墨汁，將平臺(tái)置I象限水下2 cm。實(shí)驗(yàn)9∶00 am～3∶00 pm進(jìn)行，水溫（24±1）℃。Morris 1.0軟件跟蹤記錄并分析數(shù)據(jù)。第1～6天行定位航行實(shí)驗(yàn)：按逆時(shí)針方向分別從4個(gè)象限將大鼠面向池壁置水中，觀察并計(jì)時(shí)120 s，將平臺(tái)置I象限正中水下2 cm。記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期（escape latency，EL），若120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其至平臺(tái)，停留30 s，逃避潛伏期記為120 s。檢測(cè)結(jié)束后以第1～6天逃避潛伏期的平均值為學(xué)習(xí)成績(jī)。第7天空間行探索實(shí)驗(yàn)：撤平臺(tái)，將大鼠從III象限面向池壁置水中，記錄大鼠在60 s內(nèi)各象限游泳時(shí)間，以原I象限游泳時(shí)間即空間探索時(shí)間（space exploration time，SET）為記憶成績(jī)。

1.2.7 取材 在MWM測(cè)試結(jié)束后24 h內(nèi)取海馬，左側(cè)海馬用錫箔紙標(biāo)記包裹后置于液氮中過夜，-80℃超低溫冰箱保存，備做免疫印跡（Western blot，WB）；右側(cè)海馬稱重，加入1ml甲醇-水離心液，低溫勻漿，取部分勻漿液4℃，10 000×g，離心15min，取上清，濾膜過濾后-80℃保存待測(cè)Glu含量（以μg/g計(jì)）。

1.2.8 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)Glu濃度 取海馬勻漿上清液；調(diào)整色譜條件為18-ODS色譜柱柱溫35℃，流動(dòng)相A為0.1mol/L醋酸鉀，流動(dòng)相B為甲醇，行二元梯度洗脫，流動(dòng)相經(jīng)0.45m微孔濾膜過濾，超聲脫氣，流速1.0ml/min，激發(fā)波長(zhǎng)250 nm，發(fā)射波長(zhǎng)410 nm，以Glu峰面積定量；建立Glu標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)定Glu含量。

1.2.9 WB法檢測(cè)p-AT8Ser202和Tau-5的表達(dá) 取左側(cè)海馬勻漿，提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度一致。取等量蛋白樣品稀釋，煮沸5min；另用1×SDS加樣緩沖液溶解預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物，煮沸3min。標(biāo)本15μl上樣（甘油醛-3-磷酸脫氫酶為蛋白質(zhì)上樣標(biāo)定），SDS-PAGE電泳至預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)示目的分子量出現(xiàn)為止，濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加抗體[兔抗人p-AT8Ser202單克隆抗體或小鼠抗牛Tau-5單克隆抗體（1︰200）]4℃孵育過夜，辣根酶標(biāo)記IgG（1︰200）37℃孵育2 h，DAB顯色，金盤多媒體圖像處理系統(tǒng)測(cè)陽性條帶積分吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠的MWM成績(jī)

ECT可延長(zhǎng)EL（F=119.82，P=0.011）縮短SET（F=99.93，P=0.010）。氯胺酮單獨(dú)使用亦可造成認(rèn)知障礙，而ECT和氯胺酮合用后認(rèn)知障礙反而減輕；Rg-1和氯化鋰單獨(dú)使用對(duì)認(rèn)知無影響，但與ECT合用則改善ECT后的認(rèn)知（EL：F=56.41，P=0.009；SET：F=37.71，P=0.004）。ECT與藥物有交互作 用（EL：F=62.00，P=0.001；SET：F=63.36，P=0.001）。見表1和2。

2.2 HPLC法檢測(cè)G lu的濃度

ECT可明顯增加海馬中Glu的濃度（F=273.15，P=0.003）。氯胺酮和Rg-1在ECT前后均可減少海馬Glu（ECT前：F=10.15，P=0.008；ECT后：F=35.00，P=0.012）（總效應(yīng)：F=67.95，P=0.003）；且ECT干預(yù)與氯胺酮和Rg-1有交互作用（F=33.01，P=0.015）。氯化鋰對(duì)海馬中Glu的濃度無明顯影響。見表3。

2.3 WB法檢測(cè)Tau蛋白的表達(dá)

ECT和氯胺酮、Rg-1和氯化鋰對(duì)總Tau蛋白（即Tau-5蛋白） 表達(dá)無影響：（ECT：F=1.87，P=0.322；實(shí)驗(yàn)藥物：F=0.21，P=0.907）；ECT和實(shí)驗(yàn)藥物劑無交互效應(yīng)（F=0.07，P=0.934）。ECT可增加磷酸化p-AT8Ser202的表達(dá)（F=11.13，P=0.024）；而氯胺酮、Rg-1和氯化鋰可減少p-AT8Ser202的表達(dá)（F=21.29，P=0.015）；氯胺酮、Rg-1和氯化鋰減緩磷酸化Tau蛋白增加幅度（F=12.43，P=0.040）。見附圖、表4和5。

表1 MWM成績(jī)：EL（s，n=8，±s）

表1 MWM成績(jī)：EL（s，n=8，±s）

注：1）主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；2）交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

組別 生理鹽水 氯化鋰 平均值 F值 P值無處置 35.6±4.6 34.2±5.6 37.0±7.1 25.69 0.001 ECT 84.1±8.2 41.5±5.0 58.4±18.3 54.18 0.000氯胺酮 Rg-1 47.4±3.7 35.2±4.3 56.1±4.5 50.4±9.6平均值 60.0±27.2 37.1±6.8 48.1±17.2 56.411） 0.0091）52.1±6.0 42.0±11.0 F值 145.88 17.02 119.821）P值 0.000 0.014 0.0111） （F=62.00，P=0.001）2）59.51 62.13 0.001 0.006

表2 MWM成績(jī)：SET（s，n=8，±s）

表2 MWM成績(jī)：SET（s，n=8，±s）

注：1）主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；2）交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

組別 生理鹽水 氯化鋰 平均值 F值 P值無處置 31.0±6.1 30.2±5.0 25.9±8.9 40.05 0.000 ECT 11.0±1.6 21.3±3.0 17.0±5.0 39.66 0.000氯胺酮 Rg-1 12.0±1.7 32.9±4.7 15.7±2.0 18.8±1.4平均值 20.0±9.6 26.0±5.8 21.8±8.5 37.711） 0.0041）13.8±3.2 25.8±8.2 F值 83.33 15.97 99.931）P值 0.000 0.008 0.0101） （F=63.36，P=0.001）2）22.08 56.69 0.000 0.000

表3 G lu在海馬中的濃度（HPLC法） （μmol/gprot，n=8，±s）

表3 G lu在海馬中的濃度（HPLC法） （μmol/gprot，n=8，±s）

注：1）主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；2）交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

組別 生理鹽水 氯化鋰 平均值 F值 P值無處置 48.9±7.9 46.2±8.0 42.3±8.3 10.15 0.008 ECT 177.8±35.7 170.4±37.0 150.0±40.0 35.00 0.012氯胺酮 Rg-1 39.9±8.6 37.5±6.0 135.3±30.0 114.0±24.1平均值 112.5±73.6 112.9±71.7 100.1±62.1 67.951） 0.0031）90.2±53.8 78.5±42.7 F值 98.95 90.12 273.151）P值 0.000 0.000 0.0031） （F=33.01，P=0.015）2）115.13 55.21 0.000 0.000

表4 Tau-5蛋白的表達(dá)（WB，積分吸光度值） （n=8）

表5 p-AT8Ser202蛋白的表達(dá)（WB，積分吸光度值） （n=8）

附圖 p-AT8Ser202和Tau-5的表達(dá)（WB） （n=8）

3 討論

海馬CA1區(qū)和齒狀回在大鼠空間長(zhǎng)時(shí)記憶形成中具重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ECT導(dǎo)致的認(rèn)知障礙伴發(fā)Glu在海馬內(nèi)濃度明顯升高，驗(yàn)證了過高濃度的Glu可誘發(fā)興奮性毒性，使神經(jīng)元受損，導(dǎo)致認(rèn)知障礙，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也將ECT導(dǎo)致認(rèn)知障礙的副作用與Glu的過高濃度聯(lián)系起來，揭示了其神經(jīng)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p-AT8Ser202位點(diǎn)磷酸化程度與ECT關(guān)系密切，而且與相關(guān)研究結(jié)果一致[2]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到ECT后Glu在神經(jīng)元中的濃度明顯升高的同時(shí)海馬內(nèi)磷酸化Tau蛋白p-AT8Ser202表達(dá)均上調(diào)，與武鳳英等[9]發(fā)現(xiàn)應(yīng)激可激活興奮性神經(jīng)傳遞系統(tǒng)誘導(dǎo)海馬Tau蛋白過磷酸化的研究結(jié)果一致；亦與TAN等[10]發(fā)現(xiàn)低體溫可以誘發(fā)Tau蛋白過度磷酸化的結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯胺酮單獨(dú)使用會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能減退，但與ECT時(shí)合用則可明顯減輕ECT后的認(rèn)知障礙，這兩點(diǎn)與既往研究一致。而且，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯胺酮可以減少海馬中Glu的濃度，尤其以ECT后為甚，此點(diǎn)或與氯胺酮改善ECT后認(rèn)知功能相關(guān)。推測(cè)其機(jī)制，氯胺酮屬于非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體拮抗劑，與NMDA受體通道復(fù)合物的苯環(huán)己哌啶調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合，通過變構(gòu)調(diào)節(jié)來干擾興奮性氨基酸與NMDA受體的正常結(jié)合，減輕NMDA受體過度激活所致的氧自由基損傷作用。氯胺酮還可通過阻斷已開放通道及降低通道開放頻率而阻滯NMDA受體，臨床劑量的氯胺酮有明顯的腦保護(hù)作用，可提高暴露在30mmol/L NMDA培養(yǎng)液中的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的存活率。本研究與LOO等的研究的結(jié)論一致，LOO認(rèn)為氯胺酮能夠減輕ECT后的認(rèn)知功能障礙，尤其在ECT后的一周之內(nèi)效果明顯[11]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rg-1和氯化鋰單獨(dú)短期內(nèi)應(yīng)用對(duì)認(rèn)知沒有明顯影響，但與ECT合用則可明顯逆轉(zhuǎn)ECT后的認(rèn)知能力。在三種實(shí)驗(yàn)藥物中，氯化鋰改善應(yīng)激后認(rèn)知的效果最為明顯。探究其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)無論行ECT與否，氯胺酮和Rg-1均可減少海馬中Glu濃度；而氯化鋰對(duì)Glu濃度似無明顯影響。但三種藥物都能降低ECT前后的Tau蛋白磷酸化程度，且這一過程與改善ECT后認(rèn)知能力密切相關(guān)，這一結(jié)論與以往的實(shí)驗(yàn)一致。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯胺酮、Rg-1和氯化鋰對(duì)ECT前后的總Tau蛋白表達(dá)似無明顯影響。

綜上所述，可知三種藥物作用機(jī)制的不同，氯胺酮、Rg-1可減少Glu的濃度、拮抗其興奮性毒性，逆轉(zhuǎn)Tau蛋白的過度磷酸化；氯化鋰可拮抗Glu興奮性毒性，逆轉(zhuǎn)Tau蛋白的過度磷酸化。

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