A2a受體激動劑聯(lián)合LPD對大鼠供肺組織病理結(jié)構(gòu)的影響

蔣德英，彭雪梅，易艷萍，盧春英，席 露

(1.暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510630；2.廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510140)

A2a受體激動劑聯(lián)合LPD對大鼠供肺組織病理結(jié)構(gòu)的影響

蔣德英1，彭雪梅1，易艷萍1，盧春英1，席 露2

(1.暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510630；2.廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510140)

目的 觀察A2a受體激動劑聯(lián)合低鉀右旋糖苷(LPD)對大鼠供肺組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響，探討A2a受體激動劑在供肺組織中的保存作用。方法選擇20只健康雄性SD大鼠，體重為350 g左右，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組(n=10)，L組大鼠供肺組織采用常溫LPD液進(jìn)行肺灌注，LC組則在L組的灌注液及保存液中加入A2a受體激動劑CGS21680液，灌注肺離體后置于4℃相應(yīng)組的保存液里保存6 h后，取兩組移植肺組織行光鏡下病理學(xué)觀察并進(jìn)行積分計算和統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果肺組織炎癥滲出積分方面LC組為3.5分，低于L組的9.5分，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；肺組織病理評分總分方面，L組為(10.67±1.63)分，LC組為(7.50±1.22)分，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論A2a受體激動劑可減少供體肺組織炎癥細(xì)胞浸潤程度，提高LPD液對供肺組織保存效果。

A2a受體激動劑；LPD液；病理學(xué)結(jié)構(gòu)；肺組織

肺是人體與外界大氣相通的器官，受外界環(huán)境污染大，細(xì)菌感染機(jī)會多，一個活肺保鮮期不超過五六個小時，且活肺來源有限，于是安全有效的器官保存是肺移植成功的先決條件，供肺保存液的研制成為肺移植界的一項重要課題。理想的肺灌注保存液是能防止保存期內(nèi)肺炎癥滲出，抑制肺細(xì)胞組織的水腫，并為肺保存期間提供必要的能量供給。目前廣泛用于臨床的供肺保存液是以低鉀右旋糖酐溶液(Low potassium dextran，LPD)[1]為代表的細(xì)胞外液型保存液，但LPD液對保存供肺期缺血再灌注損傷的抗炎、抗炎癥細(xì)胞浸潤的能力較差[2]。近期研究表明腺苷A2a受體能抑制中性粒細(xì)胞的炎癥浸潤，抑制炎癥因子分泌而起到抗炎作用[3]。本研究擬在LPD保存液的基礎(chǔ)上加入A2a受體激動劑CGS21680，從病理組織結(jié)構(gòu)改變方面觀察其對供肺的保存作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗遵守廣東省實驗動物飼養(yǎng)和使用規(guī)定，實驗動物為雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(300±25.12)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗場所為暨南大學(xué)動物實驗中心。

1.2 器官灌注液和保存液 LPD液購于Perfadex，Sweden；A2a受體激動劑CGS21680液購于slkchem公司(美國)。

1.3 動物模型分組與建立 采用數(shù)字隨機(jī)法將SD大鼠分為L組和LC組，每組10只。L組的肺灌注液和離體肺保存液均為LPD液；LC組是肺灌注液和保存液為LPD液加入A2a受體激動劑CGS21680液(0.1 mg/kg)的混合液。參照Fischer等[4]方法建立肺灌注模型[5]。動物先稱重量，于大鼠腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后，行氣管切開插管，接DW2000型動物呼吸機(jī)，呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為潮氣量為2.5 ml/100 g，吸呼比為1:2，通氣頻率為60次/min，術(shù)中持續(xù)機(jī)械通氣。正中開胸游離上、下腔靜脈，經(jīng)下腔靜脈注射肝素80 U/100 g，24 G動脈穿刺針以右心室流出道插入肺動脈干，結(jié)扎上下腔靜脈，在肺動脈干順行灌注灌注液，速率為240 ml/h，并在左心耳置一流出道。灌注過程中持續(xù)通氣，當(dāng)灌注肺成完全蒼白時，在中度膨脹肺(60%～70%)時，結(jié)扎氣管并取下心肺置于4℃上述保存液中。

1.4 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)、病理評分 供肺保存6 h后，各取右下肺同一部位的肺組織行福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)切片后行HE染色，由同一位實驗者在光鏡下觀察以下項目：肺泡壁清晰與完整性、肺間質(zhì)充血、肺間質(zhì)水腫、肺泡腔紅細(xì)胞滲出、炎癥細(xì)胞滲出。從以上五個方面進(jìn)行病理評分：無病理改變評為1分，病理變化輕微且位置局限為2分，病理變化顯著但位置局限或病理變化輕微但病變廣泛為3分，廣泛顯著病理改變?yōu)?分。病理總分為各觀察項目評分的總和。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，病理總分進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗；對每個病理評分的組間差別，進(jìn)行兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理組織評分 光鏡下病理LC組在肺組織清晰與完整、肺間質(zhì)水腫、肺間質(zhì)充血和肺泡腔紅細(xì)胞滲出四項評分均低于L組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，兩組在炎性細(xì)胞滲出方面LC組明顯低于L組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。肺組織的病理評分五項總分方面，L組為較LC組積分高，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)；肺組織病理評分總分方面，L組為(10.67±1.63)分，LC組為(7.50±1.22)分，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

組別 肺組織 肺間質(zhì) 肺間質(zhì) 肺泡腔L組(n=10) LC組(n=10) Z值P值清晰與完整7.50 5.50 1.48 0.14水腫8.08 4.92 1.73 0.08充血8.00 5.00 1.68 0.09紅細(xì)胞滲出8.00 5.00 1.68 0.09炎性細(xì)胞滲出9.50 3.50 3.21 0.00

2.2 肺組織病理變化 LC組肺組織結(jié)構(gòu)清晰較完整，肺泡隔少量增厚，少量肺泡壁斷裂；L組肺組織結(jié)構(gòu)較清晰完整，肺泡壁斷裂、肺間質(zhì)及肺泡見少量紅細(xì)胞滲出，肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞見空泡化及炎癥細(xì)胞，見圖1。

圖1 兩組肺組織光鏡病理(HE，×200)

3 討論

良好的肺灌注液以及肺灌注保存技術(shù)一直是肺移植手術(shù)成功的重點(diǎn)，它是減少肺缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。缺血再灌注損傷導(dǎo)致供體器官保存過程中器官損傷機(jī)理十分復(fù)雜，一般認(rèn)為是缺血再灌注過程中引起肺間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥介質(zhì)釋放，導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)。LPD液是屬于細(xì)胞外型供肺保存液，為肺移植的首選保存液，含有高濃度鈉離子、低濃度鉀離子和右旋糖酐40，低鉀可以保持內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性、減輕肺血管的收縮[6]，右旋糖酐40能改善肺微循環(huán)及保護(hù)肺泡毛細(xì)血管屏障的作用[7]。但有研究發(fā)現(xiàn)LPD液對供肺的抗炎、減少炎癥細(xì)胞的滲出、浸入方面效果較差[8]，龍小毛將LPD液經(jīng)肺動靜脈灌注后的供肺保存在4℃低溫LPD液中，發(fā)現(xiàn)80%～90%肺組織肺泡腔內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞滲出[9]。這一點(diǎn)在我們的研究中也得到證實。

腺苷作為一種內(nèi)源性嘌呤核苷，通過激活并結(jié)合與G蛋白偶聯(lián)的腺苷受體(Adenosine receptors，ARs)介導(dǎo)的。ARs包含A1R、A2AR、A2BR、A3R四種類型，其中A2AR活化后可產(chǎn)生抗炎效應(yīng)，阻止白細(xì)胞黏附以及抑制活性氧的產(chǎn)生，并抑制中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞的聚集并減弱其功能，同時減少炎癥介質(zhì)的釋放，尤以抑制TNF-α的作用最為突出，從而發(fā)揮抗炎和修復(fù)效應(yīng)。

本研究中采用在LPD保存液中加入CGS21680進(jìn)行供肺灌注和保存，肺組織病理結(jié)構(gòu)顯示在炎癥細(xì)胞滲出與離體肺組織總體病理積分兩方面LC組要明顯優(yōu)于L組，從而在病理方面證實A2a受體激活劑能有效提高供肺抗炎能力，減輕炎癥損傷，優(yōu)于單一低分子右旋糖苷保存液對供肺的保存作用。

綜上所述，A2a受體激動劑可減少供體肺組織炎癥細(xì)胞浸潤程度，能明顯改善LPD保存液在動物供肺的保存質(zhì)量，提高保存效果，對于臨床肺保存液提供了一個客觀真實的理論依據(jù)。

[1]Sim?es EA1,Cardoso PF,Pêgo-Fernandes PM,et al.An experimental rat model of ex vivo lung perfusion for the assessment of lungs regarding histopathological findings and apoptosis:low-potassium dextran vs.histidine-tryptophan-ketoglutarate[J].J Bras Pneumol, 2012,38(4):461-469.

[2]Okada Y,Kondo T.Preservation solution for lung transplantation [J].Gen Thorac Cardiovasc Surg,2009,57(12):635-639.

[3]Kumar V,Sharma A.Adenosine:an endogenous modulator of innate immune system with therapeutic potential[J].Eur J Pharmacol,2009,616(1-3):7-15.

[4]Fischer S,Hopkinson D,Liu M,et al.Raffinose improves 24-hour lung preservation in low potassium dextran glucose solution:a histologic and ultrastructural analysis[J].Ann-Thorac Surg,2001,71(4): 1140-1145.

[5]彭雪梅,席 露,王華東,等.乳化氟碳保存液對大鼠供肺的保護(hù)作用[J].中華麻醉學(xué)雜志,2013,33(9):1082-1084.

[6]Fischer S,Matte-Marty A,de Perrot M,et al.Low-potassium dex-tran preservation solution improves lung function after human lung transplantation[J].Thorac Cardiovasc Surg,2001,121(3): 594-596.

[7]Witwer T,Franke U,Fehrenbach A,et al.Impact of retrograde graft preservation in perfadex-based experimental lung transplantation [J].J Surg Res,2004,117(2):239-248.

[8]De Perrot M,Sekine Y,Fischer S,et al.Interleukin-8 release during early reperfusion predicts graft function in human lung transplantation[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,165(2):211-215.

[9]龍小毛,林 輝,李香偉,等.體外溫血持續(xù)灌注對豬供肺的保護(hù)作用[J].中華實驗外科雜志,2012,29(12):2522-2524.

Effect of A2a receptor agonist combined with low potassium dextran on the pathological structure of donor lung tissues in rats.

JIANG De-ying1,PENG Xue-mei1,YI Yan-ping1,LU Chun-ying1,XI Lu2.
1.Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510630 Guangdong,CHINA;2.Department of Anesthesiology,the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510140,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of A2a receptor agonist combined with low potassium dextran (LPD)on the pathological structure of donor lung tissues in rats,and to investigate the preservation of A2a receptor agonist in donor lungs tissues.MethodsTwenty healthy male Sprague-Dawley rats,weighing about 350 g,were randomly divided into two groups:L group(n=10,the rats'donor lung tissues were primed with LPD solution at room temperature)and LC group(n=10,the perfusion and preservation solution were added with A2a receptor CGS21680 based on that of L group).The primed lung was preserved in vitro for 6 hours in the solutions of the corresponding group at 4℃.The transplanted lung tissues were collected and observed under microscope for pathological changes.ResultsThe integral term of lung tissue inflammation of LC group(3.5 points)was significantly lower than that of L group(9.5 points),and the difference was statistically significant(P＜0.05).The total pathological score of lung tissue was(10.67±1.63)points in L group and(7.50±1.22)points in LC group,with statistically significant difference(P＜0.05).ConclusionAdenosine A2a receptor can reduce the inflammatory cells'infiltration in lung tissue of donor and improve preservation of the LPD solution for rat lung.

A2a receptor agonist;Low potassium dextran(LPD);Pathological structure;Lung tissue

R-332

A

1003—6350（2015）15—2193—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0793

2015-01-21)

廣東省科技計劃基金資助項目(編號：2060303)

彭雪梅。E-mail：464463169@qq.com