油菜種子蛋白質提取方法研究

楊

（湖南農業(yè)大學農學院，長沙410128）

油菜種子蛋白質提取方法研究

楊柳，李海林，張振乾*

（湖南農業(yè)大學農學院，長沙410128）

通過對比改進的Tris-HCl法、酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法4種方法提取油菜未成熟種子蛋白質，以期找到合適的蛋白質提取方法。結果表明，TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法所得蛋白質沉淀較多，顏色亮白，效果較好。進一步通過定量分析及雙向電泳圖譜的比較分析表明，TCA/丙酮沉淀法在2-DE圖譜上蛋白質點較多，分布均勻，圖像清晰，而DTT/丙酮法相對于本實驗中TCA/丙酮法檢測到較少的蛋白質點外，2-DE圖譜上有明顯的縱條紋。因此TCA/丙酮沉淀法為提取油菜種子中蛋白質的最優(yōu)方法。

油菜；蛋白質；提取方法；雙向電泳

利用各種預分離技術降低樣品體系復雜性，分離富集蛋白質并與現(xiàn)有的分離技術相結合，大幅度提高了蛋白質的檢測率［1，2］。目前常用的提取蛋白質的方法有：（1）PEG沉淀法，能夠簡單、快速地富集蛋白質的預分離方法；（2）TCA丙酮沉淀法［3］，具有降低次生代謝物質的干擾、減少蛋白質降解等優(yōu)點；（3）酚法［4］，利用Tris-飽和酚的特性。酚是蛋白質的良好溶劑，在樣品制備過程中，蛋白質和脂類溶于酚相，鹽、核酸、多酚和多糖等可溶性物質進入水相；（4）Tris-HCl法［5］，該方法在膜蛋白質和疏水性蛋白質的提取方面有所改善。用含SDS的Tris -HCl與TCA丙酮聯(lián)合使用提取蛋白質，用80%的丙酮洗滌以除去水溶性雜質（包括高濃度的鹽離子），比TCA丙酮法利用高速離心與丙酮洗滌的方法能更有效地排除雜質，也比傳統(tǒng)的脫鹽和透析方法要省時省力。此外，還有二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法［6］、酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法［7］、Mg/NP-40提取法［5］、Mg/NP-40/PEG4000/TCA/丙酮提取法［8］、試劑盒提取法等。隨著雙向電泳的發(fā)展，結合雙向凝膠電泳的預分離技術已成為蛋白質組學中分析蛋白質的有力工具。

油菜是我國第一大油料作物，研究其脂肪酸合成機理是目前油菜分子生物學研究的熱點和重點之一。目前，蛋白質組學研究備受關注，細胞或組織中受體分子、信號分子等參與基因表達調控即基因調控［9］均需要蛋白質的參與。授粉后20～35 d為油菜種子脂肪酸形成關鍵期［10］，本試驗以此時期的種子為材料，對各種提取方法進行研究，以期找到適合雙向電泳的蛋白質提取方法。

1 材料與方法

1.1供試材料

湘油15號授粉后20～40 d油菜種子。

1.2試劑

1.2.1 酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法試劑

TCA/丙酮溶液（含10%（W/V）三氯乙酸，0.07%DTT），0.1 M醋酸銨的甲醇溶液。

1.2.2 改良Tris-HCl法試劑

蛋白質提取液（50 mM Tris-HCl，pH 8.5，100 mM KCl，0.07%（W/V）DTT，30%甘油），80%丙酮，蛋白質提取緩沖液（0.1M Tris-HCl，pH 6.8，0.5% SDS，10%甘油，0.07%DTT），10%TCA/丙酮，80%冷丙酮。

1.2.3 TCA丙酮沉淀法試劑

樣品提取液A：10%TCA，0.07%DTT，1 mM PMSF的丙酮溶液，-20℃保存；樣品提取液B：0.07%DTT，1 mM PMSF 100%的丙酮溶液，-20℃保存。

1.2.4 二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法試劑

抽提裂解液（pH 8.0）：Lysis Buffer0.1M Tris-HCl（12.44 g）；1.4 M NaCl（81.816 g）；0.02 M Na2EDTA（7.45 g）；2%CTAB（20 g）；0.1%DIECA（1 g）；2%PVP K-30（20 g）加0.2%β-巰基乙醇后調pH值至8.0；碘代乙酰胺2-碘乙酰胺（IAM）。

1.2.5 雙向電泳試劑

（1）瓊脂糖封膠液配制：低熔點瓊脂糖0.5 g， Tirs 0.303 g，甘氨酸1.44 g，SDS 1 mL（10%SDS），溴酚藍100μL（1%溴酚藍），ddH2O定容到100 mL。

（2）裂解液：7.0 M尿素，2.0 M硫尿，4% CHAPS，30 mM Tris-HCl，pH 9.0（Bio-Rad）。

（3）水化液：2.0 M硫脲，7.0 M尿素，2% CHAPS（不含DTT，不含Bio-Lyte）（Bio-Rad）。

（4）平衡母液：6 M尿素，50 mM Tris-HCl，20%甘油，2%SDS（Bio-Rad）。

（5）10×電泳緩沖液：250 mM Tris，1.92 M glycine，1%SDS，pH 8.3（Bio-Rad）。

（6）30%丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=29∶1（Bio -Rad）。

1.3蛋白質提取

1.3.1 改良Tris-HCl法

對谷瑞升［11］等人方法進行部分修改。操作步驟為，取1 g油菜種子液氮研磨，準確稱取0.5 g粉末至10 mL離心管中，加入PVPP 0.3 g和蛋白質提取緩沖液4.5 m L（0.1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，0.5%SDS，10%甘油，0.07%（W/V）DTT），樣品混勻后置4℃震蕩浸提1 h，以充分溶解蛋白質，之后12 000 g 4℃離心20 min，吸取上清800μL，加入8 mL-20℃10%TCA/丙酮，混勻后置-20℃沉降蛋白質3 h，10 000 g 4℃離心30 min，棄上清，加入冷丙酮5 m L，渦旋，于-20℃下放置30 min，于10 000 g離心30 min，重復3次；加入冷的80%丙酮，渦旋，于-20℃下放置30 min，于10 000 g下離心30 min，重復1次；于室溫下風干10～15 min使丙酮完全揮發(fā)，置于-80℃下保存。

1.3.2 TCA丙酮沉淀法

對Damerval C等人［3］的方法進行部分修改。取1 g，-80℃保存的油菜種子置于研缽中，迅速加入液氮，再加入少量的PVPP粉，研磨至細粉狀，溫度始終低于4℃。加入預冷保存的10倍體積的樣品提取液A，于-20℃沉淀過夜；第二天4℃、15 000 r/min，離心30 min，棄上清，再加入預冷保存的10倍體積的樣品提取液B，混勻，沉淀1～2 h，4℃、15 000 r/min，離心30 min，棄上清，重復此步4次，直到粉末變成白色。最后4℃離心30 min，棄上清，沉淀制成干粉，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法

對范龍泉等［7］方法稍加修改，分別用Triton-X100和甘油替換原緩沖液中的SDS和蔗糖。稱1 g種子研磨成粉，轉至15 mL離心管，加入10倍體積-20℃預冷TCA/丙酮溶液。-20℃沉淀30 min后離心，棄上清；沉淀分別用0.1M醋酸銨甲醇溶液和冷丙酮清洗各1次，離心后沉淀室溫干燥。按100 mg干粉加入0.5～0.8 mL提取液和等體積的Tris飽和酚（pH＞7.5），4℃下放置30 min；4℃，10 000 g離心15 min分相。將酚相轉至另一干凈離心管，加入5倍體積預冷的含0.1 M醋酸銨的甲醇溶液，渦旋30 s，-20℃沉降過夜。離心，棄上清；沉淀分別用0.1 M醋酸銨甲醇溶液、冷丙酮和80%冷丙酮清洗各1次。離心，沉淀冷凍干燥后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法

對曾廣娟等［6］方法稍加修改。取1 g種子，在液氮低溫條件下研磨成粉末狀，轉進50 mL離心管；加入適量Lysis Buffer 3，加入終濃度1 mM PMSF、2 mM EDTA混勻，冰上放置5 min后加入終濃度10 mM DTT，冰浴超聲5 min（2 sec/3 sec）；4℃條件下18 000 g離心15 min，取上清；往上清中加入5倍體積的10%TCA冷丙酮，加入終濃度10 mM DTT，混勻，-20℃沉淀蛋白質液過夜；4℃條件下12 000 g離心25 min，棄上清；往沉淀中加入適量冷丙酮、終濃度為10 mM DTT，搗碎沉淀，-20℃沉淀30 min，4℃條件下30 000 g離心15 min，棄上清；重復上一步驟3次，至上清澄清；風干沉淀中殘余丙酮后，加入適量Lysis Buffer 3，加入終濃度10 mM DTT，冰浴超聲5 min（2 sec/3 sec）；4℃條件下30 000 g離心15 min，取上清；往上清中加入終濃度10 mM DTT，56℃水浴1 h；加入終濃度55 mM IAM，暗室放置45 min；加入5倍體積的冷丙酮，-20℃沉淀蛋白質液過夜；4℃條件下30 000 g離心15 min除上清；沉淀冷凍干燥后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4雙向電泳方法

1.4.1 蛋白質濃度測定

用Bradford法［12］測量出蛋白質濃度后，分裝保存在-80℃冰箱。

1.4.2 等電聚焦

按照表1程序進行等電聚焦。

表1 等電聚焦程序

1.4.3 第二向SDS電泳

第二向SDS-PAGE采用分離膠濃度為12%。用低熔點瓊脂糖封膠液（0.5%低熔點瓊脂糖，25 mM Tris，198 mM甘氨酸，0.1%SDS，痕量溴酚蘭）封閉。待封膠液凝固后，在酸性端加相對分子質量標準蛋白質，進行第二向垂直電泳。5 w/gel恒功率電泳，待溴酚藍前沿進入分離膠后，再15 w/gel恒功率電泳，直到溴酚藍前沿到達距玻璃板底部0.5～1 cm處，結束電泳，準備剝膠與染色。

1.4.4 染色

考馬斯亮藍染色ddH2O洗3次，每次15 min，12%TCA固定2 h后，ddH2O洗3次，每次15 min。20%甲醇，1.6%磷酸，8%硫酸銨和0.08%考馬斯亮藍G250染色16～24 h，ddH2O漂洗脫色。

1.4.5 圖像分析

用PDQest8.0圖像分析軟件對掃描圖像分析差異點。

2 結果與分析

2.1不同提取方法的比較

高油酸油菜授粉20 d后種子中含有大量的色素、酚等次生代謝物質，這些物質的存在會嚴重影響第一向的等電聚焦。為了獲得高質量的2-DE蛋白質樣品，本試驗采用了4種不同的蛋白質提取方法，即TCA/丙酮沉淀法、二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法、改良的Tris-HCl法和酚-甲醇/醋酸銨沉淀法處理樣品。4種提取方法獲得的蛋白質產量有所差異（表1）。改良的Tris-HCl法提取的蛋白質沉淀雖然步驟簡單、提取時間短、操作容易，但是沉淀顏色偏黃，而且里面離子含量過多，聚焦容易失敗，不利于雙向電泳。酚-甲醇/醋酸銨沉淀法所得蛋白質沉淀不多，顏色較白，但是步驟較繁瑣、耗時相對較長，蛋白質損失較多。TCA/丙酮沉淀法和二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法所得蛋白質沉淀干重差不多，顏色相近，都容易溶于裂解液，蛋白質凈產量都高，而且在步驟、操作性、提取時間上相差不大。綜合考慮，二方法在現(xiàn)階段提取蛋白質都為較合適的方法，且都優(yōu)于改良的Tris-HCl法和酚-甲醇/醋酸銨沉淀法。尋找最優(yōu)方法，需通過進一步定量分析比較。

表2 不同提取方法所得油菜種子蛋白質

2.2 TCA/丙酮沉淀法和二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法的對比

當Bradford工作液考馬斯亮藍G-250和蛋白質在酸性條件下結合時，在一定的范圍內，蛋白質含量與595 nm的吸光度成正線性相關關系（圖1）。

圖1 定量的標準曲線

由SDS-PAGE圖譜（圖2）可見，TCA/丙酮沉淀法（B）與二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法（A）相比，蛋白質條帶稍強，在14 kD和20 kD處條帶較強。從定量信息（表3）和電泳圖譜看，兩個樣品的蛋白質總量都是合格的，能繼續(xù)后續(xù)實驗。

表3 定量信息

注：樣品A表示用二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法得到的，樣品B表示用TCA/丙酮沉淀法得到的。

圖2 兩種蛋白質提取方法的SDS-PAGE圖譜比較

2.3兩種蛋白質提取方法效果比較

二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法和TCA/丙酮沉淀法提取的油菜種子蛋白質得到的2-DE圖譜如圖3所示。在相同雙向電泳條件下，用TCA/丙酮沉淀法制備的蛋白質樣品（圖3-a）的雙向電泳結果優(yōu)于二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法（圖3-b），主要是得到的蛋白質點聚合較好，凝膠背景比較清晰，圖譜質量好且縱橫紋較少，可能是二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法提取的樣品中蛋白質有所降解。經(jīng)PDQest8.0圖像分析軟件對2種蛋白質提取方法得到的2-DE圖譜進行分析，在TCA/丙酮沉淀法樣品的2-DE圖譜（圖3-a）中分別檢測到558個蛋白質點；而在二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法的2-DE圖譜（圖3-b）中分別檢測到331個蛋白質點，明顯比TCA/丙酮沉淀法少227個蛋白質點。而且TCA/丙酮沉淀法在操作方面也優(yōu)于二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法。因此，對于油菜種子蛋白質提取方法的研究可以發(fā)現(xiàn)，TCA/丙酮沉淀法比較好。

圖3 兩種蛋白質提取方法的2-DE圖譜比較

3 小結與討論

3.1蛋白質提取方法比較

蛋白質的提取方法中最常用的是TCA/丙酮沉淀法，在提取過程中組分損失較少，具有廣泛的適用性，在動植物組織［13］以及微生物材料中都能取得很不錯的分離效果，而且在2-DE圖譜上蛋白質點較多，分布均勻，適宜油菜種子中蛋白質的提取。改良Tris-HCl提取法除了分離到較多的中等分子量的蛋白質外，還得到了比例相當?shù)母叻肿恿亢偷头肿恿康鞍踪|。但是Tris堿雖可防止蛋白質的水解，卻引入鹽離子，會導致IEF（等電點聚焦）電壓過低，從而影響聚焦。酚-甲醇/醋酸銨沉淀法分離得到的蛋白質點數(shù)的比例在堿性區(qū)域（p I 4～7）比Tris-HCl提取法得到的蛋白質點的比例高，但是總量相對較少。二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法所得蛋白質沉淀多，純度高，易溶于裂解液，且蛋白質凈產量都高，但在本實驗中比TCA/丙酮法檢測到蛋白質點少，且2-DE圖譜上有明顯的縱條紋。

3.2蛋白質提取方法對雙向電泳的影響

蛋白質樣品的制備直接影響雙向電泳的分辨率和重復性，特別是植物細胞有很厚的酚類、醌類等次生代謝物質，如果樣品處理不當，這些物質會干擾第一向IEF，同時不恰當?shù)牡鞍踪|沉淀方法會導致一些膜蛋白質和疏水性蛋白質的丟失［14］。植物組織的蛋白質組成是動態(tài)的，至今沒有一種通用的制備方法能將樣品中的蛋白質全部提取出來。蛋白質制備方法雖然很多，但都盡可能多的提高樣品蛋白質的溶解度，提取最大量的蛋白質，減少蛋白質損失；減少雙向電泳干擾物（主要有鹽類、脂類、多糖和核酸等），以免其破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用。

［1］ Espagne C，Martinez A，Valot B，et al.Alternative and effective proteomic analysis in Arabidopsis［J］.Proteomics，2007，7：3788-3799.

［2］ Widjaja I，Naumann K，Roth U，et al.Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low-abundance proteins differentially regulated during plant defense［J］.Proteomics，2009，9：138-147.

［3］ Damerval C，Vienne D，Zivy M，et al.Technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling protein［J］.Electrophoresis，1986，7（1）：52-54.

［4］ Isaacson T，Damasceno CM，Saravanan RS，et al.Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissu［J］.Nature Protocol，2006，1：769-774.

［5］ 梁書劍，張 萌，王 巍，等.雙向電泳比較兩種方法獲得的水稻葉片蛋白質［J］.生物學雜志，2009，26（3）：68-71.

［6］ 曾廣娟，李春敏，張新忠，等.適于SDS-PAGE分析的蘋果葉片蛋白質提取方法［J］.華北農學報，2009，24（2）：75-78.

［7］ 范龍泉，胡新明，趙進峰，等.甜瓜幼苗根系總蛋白質提取方法的篩選及其電泳條件的建立［J］.河北農業(yè)大學學報，2012，35（4）：33-36，50.

［8］ 鐘 俐，馬成梅，梁永增，等.甜瓜葉片中Rubisco的去除及雙向電泳體系的優(yōu)化［J］.植物生理學報，2012，48（3）：303-309.

［9］ G?rg A，Weiss W，Dunn MJ.Current two-dimensional eletrophoresis technology for proteomics［J］.Proteomics，2004，4：3665-3685.

［10］Peng Qi，Hu Yan，Du Pei-Fen，et al.Construction of SSH library with different stages of seeds development in Brassica napus L.［J］.Acta Agronomica Sinica，2009，35（9）：1576-1583.

［11］谷瑞升，劉群錄，陳雪梅，等.一種省時高效的木本植物蛋白質雙向電泳分析方法［J］.北京林業(yè)大學學報，1999，21（5）：7-10.

［12］Bradford MM.A rapid method for the quantification ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72：248-254.

［13］Wang X，Chang L，Wang GC，et al.Protein extraction from the earthworm Eisenia fetidafor 2-DE［J］.Proteomics，2010，10（5）：1095-1099.

［14］羅澤宇，楊粵軍，劉選明.擬南芥蛋白質組研究中雙向電泳技術條件的優(yōu)化［J］.激光生物學報，2008，17（4）：539-543.

Study on Protein Extraction Methods for Seeds of Rapeseed

YANG Liu，LIHai-lin，ZHANG Zhen-qian*
（College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

To screen optimal protein extraction method for immature seeds of rapeseed，four methods，the improved Tris-HClmethod，phenol extraction-methanol/ammonium acetate precipitation，TCA/acetone precipitation and DTT/acetone method，were compared.The results showed that the TCA/acetone precipitation method and DTT/acetonemethod could gainmore protein precipitation，more brightwhite color，and the effectwas better.Further quantitative analysis and twodimensional electrophoresis comparative analysis showed that TCA/acetone precipitation method could gain more protein points on 2-DEmap，and the distribution was uniform，the image was clear，while DTT/acetonemethod detected less protein points，and the 2-DE map had obvious vertical stripes.So TCA/acetone precipitationmethod was the optimal protein extractionmethod for seeds of rapeseed.

rapeseed；protein；extractionmethod；two-dimensional electrophoresis

Q51；S565.4

A

1001-5280（2015）01-0011-05 DOI：10.3969/j.issn.1001-5280.2015.01.04

2014 10- 28

楊 柳（1982-），女，湖南湘陰人，碩士，實驗師，從事油菜育種研究，Email：yxtl914@sohu.com。*通信作者。

國家自然科學基金項目（31201240）；湖南農業(yè)大學青年基金（12QN27）。