富含多酚類(lèi)植物RNA提取的研究進(jìn)展

劉

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家油料作物改良中心湖南分中心，長(zhǎng)沙410128）

富含多酚類(lèi)植物RNA提取的研究進(jìn)展

劉芳，官春云*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家油料作物改良中心湖南分中心，長(zhǎng)沙410128）

摘 要：植物體內(nèi)廣泛存在多糖、多酚等次生代謝物，由于其易被氧化，且難以與核酸分離，導(dǎo)致了RNA提取困難。針對(duì)植物多酚類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性進(jìn)行分析，將現(xiàn)有的RNA提取方法進(jìn)行分類(lèi)，并對(duì)它們的原理及優(yōu)劣進(jìn)行了論述與評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：植物；RNA提??；多酚；CTAB-LiCL法；SDS-酸酚法

RNA，即Ribonucleic Acid，是一種極為重要的生物大分子物質(zhì)。它能夠傳遞遺傳信息，是DNA參與蛋白質(zhì)合成的重要媒介。任何基因功能的有效發(fā)揮均依賴RNA的表達(dá)與調(diào)控，所以RNA在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域占有重要地位。

高質(zhì)量的RNA提取是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的必要前提，如cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、熒光定量PCR檢測(cè)、Northern雜交等。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵所在［1］。

目前，RNA提取主要采用的是Chomczynski等提出的異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，即Trizol法［2］。由于其高效簡(jiǎn)潔，在動(dòng)植物細(xì)胞RNA提取上廣泛運(yùn)用，但無(wú)法提取富含多酚類(lèi)植物組織總RNA［3］。多酚是植物細(xì)胞中的一類(lèi)次級(jí)代謝物，其種類(lèi)繁多，結(jié)構(gòu)各異，含量?jī)H次于纖維素［4］，因其具有多個(gè)酚基團(tuán)而得名。多酚易被氧化形成醌類(lèi)物質(zhì)與RNA不可逆的結(jié)合，導(dǎo)致提取的RNA純度降低，影響后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

多酚為RNA提取增加了難度，同時(shí)多酚類(lèi)植物廣泛存在，如草莓［5］、葡萄［6］、棉花［7］、芒果［8］等都富含多酚。因此如何應(yīng)對(duì)多酚類(lèi)植物RNA提取的難題亟待解決。本文對(duì)含多酚類(lèi)植物的RNA提取方法進(jìn)行分析總結(jié)，主要從多酚生物學(xué)特性、RNA提取方法以及不同沉淀方法三個(gè)方面進(jìn)行了闡述。

1　植物多酚的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性

多酚主要存在于植物的皮、果、種子及葉中，依據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，可以分為水解單寧（蒬酸酯類(lèi)多酚）和縮合單寧（黃烷醇類(lèi)多酚或原花色素）（圖1）。另有研究表明，縮合單寧（原花色素）的含量是影響植物RNA提取的重要因素［9］。

圖1　植物多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式［4］

植物多酚富含豐富的鄰位酚羥基官能團(tuán)，這使得它具備了如下的生物性質(zhì)：（1）植物多酚極易同蛋白質(zhì)、多糖通過(guò)氫鍵作用發(fā)生復(fù)合反應(yīng)，從而抑制生物酶的活性［10］；（2）植物多酚能夠與Cu2+、Zn2+等金屬離子絡(luò)合，使含這些離子的金屬酶活性受到抑制，這可能也是多酚具有抑制酶活性、抗病毒、抗微生物等生物活性的原因之一［11］；（3）植物多酚易被氧化為醌類(lèi)物質(zhì)（醌類(lèi)物質(zhì)易于同大分子RNA結(jié)合）［12］，具備較強(qiáng)的生物還原能力。

由于植物多酚的強(qiáng)還原性，使得它成為植物抵御逆境脅迫的一種重要次級(jí)代謝物。在棉花中，植物多酚的積累能夠抑制病蟲(chóng)害的產(chǎn)生［13］。在干旱、高溫、強(qiáng)烈的紫外線照射下，植物多酚能夠高效清除細(xì)胞因逆境脅迫產(chǎn)生的氧自由基，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性［14］。在低溫環(huán)境中，植物細(xì)胞合成大量多酚，借此來(lái)提高細(xì)胞質(zhì)濃度，降低冰點(diǎn)，維持細(xì)胞正常功能的發(fā)揮［15］。因此，植物多酚雖然給RNA提取造成困擾，但其對(duì)細(xì)胞維持生理學(xué)功能起到關(guān)鍵作用，是植物正常生長(zhǎng)所必須的一類(lèi)高分子化合物。

植物多酚根據(jù)其溶解性分為難溶性多酚和可溶性多酚，其中后者是RNA提取的主要障礙?？扇苄远喾泳邆湟欢O性，易溶于丙酮、乙酸乙酯和乙醚，在有機(jī)溶劑中加入少量酸性或一定比例的水，形成強(qiáng)極性的萃取劑，可以提高多酚的提取效率［16］。林娜等［17］采用乙酸乙酯與PVP對(duì)樣品進(jìn)行前處理，高質(zhì)量提取出了油樟葉片的總RNA。因此，充分認(rèn)識(shí)植物多酚，針對(duì)其理化性質(zhì)，改良實(shí)驗(yàn)方法，可以克服多酚對(duì)植物總RNA提取的干擾。

2　富含多酚類(lèi)植物總RNA提取方法

目前，植物總RNA提取方法有Trizol法、試劑盒法（異硫氰酸胍法）、十二烷基硫酸鈉-酸酚法（SDS-酸酚法）［18］、十六烷基三甲基溴化銨-氯化鋰法（CTAB-LiCl法）［19］、高氯酸鹽法［20］等。李菁芳等［21］依據(jù)提取液的性質(zhì)，將RNA提取法分為氧化劑法和還原劑法，其中氧化劑RNA提取法包括Trizol法、異硫氰酸胍法、高氯酸鹽法，還原劑RNA提取法包括SDS-酸酚法、CTAB-LiCl法。

氧化劑RNA提取法（如Trizol法）最先運(yùn)用于動(dòng)物細(xì)胞總RNA的提取，其原理是利用提取液中異硫氰酸胍的強(qiáng)變性氧化能力使細(xì)胞膜裂解、蛋白質(zhì)變性，抑制內(nèi)源RNase活性的發(fā)揮，同時(shí)使核酸釋放于水相之中。該方法具備操作簡(jiǎn)單、RNA提取完整性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于一些次生代謝物含量少的植物組織。但是，氧化劑RNA提取法在植物組織總RNA提取中還存在較大局限性，這是因?yàn)槎鄶?shù)植物組織中均積累有多酚類(lèi)物質(zhì)，而多酚類(lèi)物質(zhì)在提取的過(guò)程中會(huì)被氧化成棕褐色的醌類(lèi)化合物，從而與核酸大分子不可逆結(jié)合，使用氯仿抽提去除多酚類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)，造成RNA丟失［22］，多糖會(huì)形成膠狀沉淀物，與小分子核酸共沉淀［23］。因此，氧化劑RNA提取法不適用于富含多酚類(lèi)植物總RNA的提取。

目前，還原劑法成為富含多酚類(lèi)植物總RNA提取的主要方法，其依賴于β-巰基乙醇清除提取液中氧化性物質(zhì)，提供一個(gè)強(qiáng)還原性環(huán)境，從而保證多酚類(lèi)物質(zhì)不被氧化［24］，再利用PVPP（交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮）、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、CTAB與多酚極強(qiáng)的絡(luò)合能力，經(jīng)氯仿抽提，借以將大部分的多酚類(lèi)物質(zhì)清除，從而高質(zhì)量的提取植物總RNA。還原法具體分為兩種：CTAB-LiCl法、SDS-酸酚法。

CTAB-LiCl法是一種廣泛運(yùn)用的RNA提取方法，分別提取了百合［25］、山藥［26］、油菜種子［27］、紅樹(shù)［28］等多種植物的總RNA。其提取的RNA具備純度高、產(chǎn)率高的特點(diǎn)。

CTAB，十六烷基溴化氨，是一種陽(yáng)離子表面活性劑，在高離子強(qiáng)度的溶液里，CTAB能夠與蛋白質(zhì)、多酚和中性多聚糖形成復(fù)合物沉淀，使核酸溶解于水相之中，達(dá)到分離核酸的目的。PVP，其自身的CO-N=基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)。原花色素類(lèi)物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP形成穩(wěn)定的復(fù)合物［29］。高濃度的氯化鈉（2 mol/L）為CTAB提供了一個(gè)高鹽的環(huán)境，促使其與蛋白質(zhì)、中性多糖形成復(fù)合物，但并不能改變酸性多糖的溶解性質(zhì)。因此，酸性多糖的清除依賴于氯化鋰對(duì)大分子核酸的沉淀，而此時(shí)酸性多糖依然溶解于上清之中。

CTAB-LiCl法能夠高質(zhì)量的提取多酚類(lèi)植物總RNA，但依然存在些許不足。65℃的水浴加熱CTAB法提取植物總RNA非常重要。在這個(gè)溫度下，CTAB可以增加細(xì)胞膜的表面張力，使蛋白質(zhì)變性，使核酸高效的從細(xì)胞中釋放出來(lái)，提高RNA提取產(chǎn)率；同時(shí)，CTAB與多酚、多糖等雜質(zhì)結(jié)合能力也隨著溫度的提高而增強(qiáng)。若不經(jīng)過(guò)65℃溫育，CTAB-LiCl法所提取的總RNA，因雜質(zhì)含量高，而無(wú)法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。但是，65℃為RNA的變性溫度，在成分復(fù)雜的植物RNA提取混合液中，長(zhǎng)時(shí)間的溫育對(duì)RNA的結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞，從而導(dǎo)致RNA的降解，產(chǎn)率下降。

SDS-酸酚法經(jīng)多次改良，也廣泛應(yīng)用于多酚類(lèi)植物總RNA的提取。

SDS，十二烷基硫酸鈉，一種陰離子表面活性劑，能夠使蛋白質(zhì)變性、裂解細(xì)胞膜，而使核酸溶于提取液中。不需要溫育加熱，常溫下具備較強(qiáng)的裂解效果。苯酚具備強(qiáng)腐蝕性，對(duì)蛋白質(zhì)有著極強(qiáng)的變性作用，可以完全抑制內(nèi)源RNase活性的發(fā)揮。植物粉樣經(jīng)SDS提取液裂解，由酚、氯仿混合抽提，可以將溶液中蛋白質(zhì)、多糖、SDS、DNA分離至有機(jī)相中，而RNA則留在上清之中。與CTAB-LiCl法相比，SDS-酸酚法具有操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短的特點(diǎn)。但是，在RNA提取過(guò)程中，較高含量的多酚類(lèi)雜質(zhì)，也是該方法的致命缺陷。常規(guī)SDS-酸酚法所提取的植物總RNA無(wú)法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，需要借助于PVPP提升其去除多酚雜質(zhì)的能力。

3　沉淀劑對(duì)富含多酚類(lèi)植物RNA提取的影響

3.1LiCl

LiCl是一種強(qiáng)脫水劑，可以降低核酸（DNA和 RNA）在溶液中的溶解度，使蛋白質(zhì)從染色質(zhì)上脫離。LiCl的濃度高低使其具備針對(duì)核酸（DNA和RNA）沉淀選擇特異性。在溶液中，1 M LiCl能特異性的結(jié)合RNA大分子而選擇性沉淀，將DNA留在上清之中［30］；但隨著其濃度提高，LiCl與DNA分子結(jié)合能力逐漸增強(qiáng)，其沉淀RNA的效率不斷降低［31］，所以合適的濃度是保證RNA提取純度的關(guān)鍵。LiCl與RNA分子結(jié)合發(fā)生沉淀是一個(gè)緩慢的過(guò)程，為了加快LiCl與RNA分子的結(jié)合效率，同時(shí)保證RNA分子不被降解，一般采取的措施是將其混合液放置于4℃下靜置數(shù)小時(shí)。部分學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)iCl沉淀時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起RNA的降解，進(jìn)而影響總RNA的產(chǎn)率。但是宋蓓等［32］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明RNA產(chǎn)率隨著沉淀時(shí)間的延長(zhǎng)而大幅增加。

LiCl法沉淀的RNA純度高、完整性好，但是依然存在著諸多不足。首先，LiCl在與RNA分子反應(yīng)的同時(shí)，也會(huì)部分與多糖多酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)合沉淀。如提取富含多酚類(lèi)植物（如棉花、油茶、油樟等）的RNA時(shí)，由于組織中多酚類(lèi)物質(zhì)高于一般植物，致使其提取液中仍含有大量雜質(zhì)，經(jīng)LiCl沉淀所得RNA中多酚類(lèi)雜質(zhì)含量較高而無(wú)法用于后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)。所以使用LiCl沉淀RNA的前提是CTAB、PVPP等高效的將植物組織中的多酚、多糖類(lèi)雜質(zhì)清除。其次，LiCl沉淀會(huì)造成小分子RNA的丟失，同時(shí)沉淀中殘存的鋰離子也會(huì)抑制RNA的反轉(zhuǎn)錄。

3.2乙二醇丁醚

乙二醇丁醚，又名丁氧乙醇，具有刺激性氣味。在鈉離子濃度為80 mmol/L時(shí)，0.4倍體積的乙二醇丁醚能選擇性沉淀多糖，而且1倍體積的乙二醇丁醚能溶解多酚類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)沉淀核酸［33］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，乙二醇丁醚對(duì)RNA具備良好的沉淀效果，并相繼應(yīng)用于草莓、麻瘋樹(shù)種子［34］。淳俊等［34］以乙醇、異丙醇、乙二醇丁醚設(shè)立對(duì)照試驗(yàn)，依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為乙二醇丁醚沉淀效果遠(yuǎn)大于乙醇和異丙醇。張容等［35］認(rèn)為，濃度為50%的乙二醇丁醚可以沉淀RNA的同時(shí)將多酚溶解，經(jīng)離心除去。但是李菁芳等［21］、尤超等［36］使用乙二醇丁醚提取杉樹(shù)、銀杏等植物材料后，認(rèn)為乙二醇丁醚在去除多糖多酚的過(guò)程中，造成了RNA的大量流失。綜上所述，乙二醇丁醚能在沉淀RNA的同時(shí)仍然保持多糖多酚類(lèi)雜質(zhì)在溶液中的溶解度，提取的RNA純度高且操作步驟簡(jiǎn)單，但是其對(duì)所提取的植物材料范圍有著一定的局限性，若含有多糖多酚類(lèi)雜質(zhì)過(guò)高的植物組織（銀杏、油樟等）則不適用于該法的RNA提取。

3.3乙醇及異丙醇

乙醇、異丙醇，二者都是良好的RNA沉淀劑。但是在使用乙醇沉淀RNA時(shí)，需要同時(shí)加入終濃度為0.3 M的醋酸鈉，這是因?yàn)殁c離子會(huì)中和RNA磷酸骨架上的負(fù)電荷，在酸性環(huán)境中促進(jìn)RNA的疏水復(fù)性，再加入2倍體積的乙醇，經(jīng)一定時(shí)間的孵育，可以使RNA有效沉淀［37］。與使用乙醇沉淀RNA相比，異丙醇法更為簡(jiǎn)單，向抽提上清中加入等體積異丙醇，低溫孵育便可獲得RNA沉淀。但經(jīng)異丙醇沉淀所得RNA相較于乙醇則質(zhì)地排布更加緊密，不利于70%乙醇清洗及Li+、Cl-等離子型雜質(zhì)的清除。二者沉淀RNA效率極高，但針對(duì)多糖多酚類(lèi)雜質(zhì)缺乏針對(duì)性清除能力，致使沉淀中裹挾有大量的多糖多酚類(lèi)物質(zhì)，不利于下一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

4　總結(jié)及展望

富含多糖多酚類(lèi)植物組織因雜質(zhì)含量高，而難以得到高質(zhì)量的RNA。植物多糖能夠抑制多種生物酶的活性［38］，其理化性質(zhì)與RNA非常接近［39］，能夠與核酸、蛋白質(zhì)、多酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)生結(jié)合，是影響RNA提取的重要因素。但植物多糖的清除難度與多酚相比較小，低濃度乙醇法［40］、醋酸鉀法［41］、LiCl法［30］、乙二醇丁醚法［42］在清除植物多糖過(guò)程中有著廣泛的應(yīng)用，并取得了良好的效果。由此，植物多酚成為影響植物RNA提取最為主要的因素。植物多酚因具備強(qiáng)的被氧化和絡(luò)合能力而不易被有效清除。植物多酚是植物體抵御逆境脅迫的一類(lèi)重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物［43］，故生長(zhǎng)環(huán)境越惡劣，其體內(nèi)積累的多酚類(lèi)物質(zhì)越多。同時(shí)，多酚在植株重要器官如花、種子、果實(shí)、根，均有大量積累。這使得我們必須正視多酚在RNA提取中所發(fā)揮的負(fù)面作用，并根據(jù)植物材料的特性（多糖、多酚含量），選擇合適的方法。

富含多酚類(lèi)植物總RNA提取主要依賴于還原劑法，即CTAB-LiCl法和SDS-酸酚法。近年來(lái)，許多學(xué)者針對(duì)此兩種方法進(jìn)行了多種改良，但其原理并無(wú)太大改變。CTAB-LiCl法能夠有效清除植物多酚，原因在于CTAB、PVP或PVPP均可與多酚結(jié)合，其中CTAB結(jié)合多酚能力大于PVP，LiCl在與RNA結(jié)合沉淀的同時(shí)，可將殘余少量多酚溶解于上清液中，進(jìn)而增加了所提RNA的純度。PVP或PVPP，能夠通過(guò)氫鍵與多酚發(fā)生絡(luò)合［29］，但其功能的發(fā)揮嚴(yán)格取決于提取溶液的pH值，在pH＜8時(shí)，PVP高效絡(luò)合多酚；當(dāng)pH值≥8時(shí)，PVP或PVPP發(fā)生復(fù)性，與多酚分離。這在清除啤酒中多酚回收利用PVPP過(guò)程中多有應(yīng)用［44］。目前，CTAB-LiCl法中RNA提取緩沖液pH值均≥8，這就造成PVP或PVPP無(wú)法參與植物多酚的絡(luò)合反應(yīng)，其改良方法尚需進(jìn)一步研究。部分學(xué)者［45］在研磨植物粉樣時(shí)，加入了大量的PVP或PVPP，經(jīng)研磨混勻，使得PVP或PVPP充分的與細(xì)胞及多酚類(lèi)物質(zhì)接觸，但并不能達(dá)到保護(hù)多酚類(lèi)物質(zhì)不受多酚氧化酶的作用，原因有以下三個(gè)方面：（1）研磨造成了植物細(xì)胞壁嚴(yán)重?fù)p傷，但并未對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)產(chǎn)生破壞，故多酚類(lèi)物質(zhì)未能高效釋放；（2）PVP或PVPP只有在水溶液中才能與多酚發(fā)生氫鍵絡(luò)合反應(yīng)，并需要一定的溫度條件；（3）液氮造成的局部低溫，對(duì)蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮有著強(qiáng)烈抑制，所以多酚氧化酶不能對(duì)多酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)揮作用。因此，正確看待多酚，充分了解多酚類(lèi)物質(zhì)的理化性質(zhì)，合理使用多酚螯合劑和方法，是獲得高質(zhì)量RNA的重要保證。

RNA提純?nèi)ルs的過(guò)程是以犧牲其產(chǎn)量為前提的，如在去除多糖雜質(zhì)的過(guò)程中會(huì)造成RNA大量的損失。降解、產(chǎn)率和純度是RNA提取方法優(yōu)劣的重要參考，但三者往往相互矛盾、相互制約。在獲得RNA高產(chǎn)率的同時(shí)，會(huì)伴隨著大量雜質(zhì)，使得RNA純度不高，即高產(chǎn)量的RNA其雜質(zhì)含量也高，同時(shí)由于雜質(zhì)的影響會(huì)使RNA出現(xiàn)降解現(xiàn)象；純度高的RNA條帶清晰銳利，不會(huì)出現(xiàn)降解，但是其產(chǎn)量很低，即大多RNA在除雜的過(guò)程中被裹挾在雜質(zhì)中被同時(shí)除去。降解、產(chǎn)率和純度無(wú)法同時(shí)得到解決，只能力求一個(gè)適中的方法去平衡三者的關(guān)系。

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中圖分類(lèi)號(hào)：Q946.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5280（2015）01-0091-05

DO I：10.3969/j.issn.1001-5280.2015.01.22

收稿日期：2014 09- 11

作者簡(jiǎn)介：劉 芳（1988-），女，山東棗莊人，碩士研究生，Email：liupanpan1988@sina.cn。*通信作者：官春云，中國(guó)工程院院士，教授，博導(dǎo)，主要從事油菜遺傳育種和栽培，Email：guancy2011@yaliyun.com。

Research Progress on RNA Extracting From Plants Rich in Polyphenols

LIU Fang，GUAN Chun-yun*
（College of Agronomy/National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

Abstract：Polyphenols and polysaccharide and other secondary metabolites are widely found in plants，which are susceptible to be oxidated and difficult to be separated from the nucleic acid，which results in difficult extracting of RNA.In this paper，structure and biological characteristics of polyphenolswere analyzed，the existing RNA extractionmethodswere classified，and their principle and advantages and disadvantages were evaluated.

Keywords：plant；RNA extracting；polyphenols；CTAB-LiCLmethod；SDS-phenolmethod