赤蘚糖醇生產母液中糖醇組分的定性鑒定*

趙祥穎，張立鶴，楊麗萍，韓延雷，田延軍，張家祥，劉建軍

(山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，山東濟南，250013)

赤蘚糖醇是一種新型的功能性多元醇類甜味劑，甜味特征與蔗糖相似，而熱量卻接近零，作為甜味劑和填充劑在食品中添加可避免蔗糖或葡萄糖等糖品帶來的高熱量、糖尿病不適、致齲齒等困擾［1-2］。赤蘚糖醇作為一種天然產物廣泛存在于真菌(如海藻、蘑菇等)、水果(梨、甜瓜、葡萄等)以及各類發(fā)酵食品中(如葡萄酒、清酒、醬油、干酪等)，在人或動物的血液、尿液中也可檢測到該成分［3-4］。動物實驗和臨床研究表明，赤蘚糖醇食用安全無毒［1］，因為其安全性和優(yōu)越的加工性能，商品赤蘚糖醇1990年一經面市就受到食品加工行業(yè)的歡迎，可作為香味促進劑、保濕劑、穩(wěn)定劑、增稠劑等替代蔗糖在各種食品和飲料中添加［5］。此外，研究證明它還具有清除自由基抗氧化活性，可以預防高血糖癥對血管壁的傷害［6］。

商品赤蘚糖醇是以葡萄糖為原料，經耐高滲酵母菌株發(fā)酵轉化生成。雖然，已經面市多年，但與其生產相關的研究依然活躍［7-10］，研究內容主要集中在菌種的篩選和工藝條件的優(yōu)化，而對生產下游技術的和副產物的研究相對較少［11］。赤蘚糖醇的生產下游提取工藝為:發(fā)酵液經菌體分離、脫色、凈化、濃縮結晶、再經重結晶精制［12］，重結晶母液返回工序循環(huán)利用，一次結晶母液經多次濃縮回收赤蘚糖醇后廢棄。廢棄母液是赤蘚糖醇生產中主要副產物之一，每生產1t赤蘚糖醇就會產生大約0.8～1 m3廢棄母液，因為缺乏有效的處理方法，生產企業(yè)現一般將母液作為污水處理排放，即浪費了資源，又增加了環(huán)境污染負荷和企業(yè)污水處理費用。作者等人［11］曾就回收母液中的赤蘚糖醇進行研究，在此過程中發(fā)現母液中除赤蘚糖醇外，還含有另外兩種未知組分，初步分析認為這兩種組分應是赤蘚糖醇發(fā)酵過程中產生的其他多元糖醇產物。本研究擬對這兩種未知糖醇組分進行鑒定，為赤蘚糖醇母液的進一步資源化利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

赤蘚糖醇母液由山東濱州三元生物科技有限公司提供。赤蘚糖醇標準品，由本實驗室用商品赤蘚糖醇精制，純度99.9%。其他試劑及標準物質從試劑公司購買。色譜柱:氨基柱(填料:Hypersil NH25μm，尺寸:4.6 mm ×250 mm)，大連依利特分析儀器有限公司;糖分析柱(Shodex SC1011，鈣型，8.0mm ×300 mm)，昭和電工科學儀器(上海)有限公司。

1.2 儀器設備

UlitiMate3000標準型高效液相色譜儀，戴安(中國)有限公司;RI230型示差折光檢測器，昭和電工科學儀器有限公司。

1.3 分析測定方法

1.3.1 HPLC 糖醇分析條件

赤蘚糖醇生產母液，經脫色、除離子等凈化處理后，配制成固形物1% ～2%的樣品進樣。其他標準物質配制成約1%的濃度進樣。

氨基柱色譜條件:流動相為80∶20的乙腈和水，流速 0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫60 ℃。

糖分析柱色譜條件:流動相為去離子水，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫 80 ℃。

1.3.2 液質聯用分析

赤蘚糖醇母液液質聯用分析數據，是委托相關機構檢驗所得。

2 結果與分析

2.1 母液預處理及標準糖醇的選擇

本文分析使用的赤蘚糖醇母液是生產母液經活性碳脫色、離子交換脫鹽、濃縮結晶回收赤蘚糖醇后所得母液［11］。母液HPLC氨基柱色譜圖如圖1。

圖1 赤蘚糖醇母液的HPLC色譜圖(氨基柱)Fig.1 The HPLC chromatogram of erythritol mother liquor(NH2column)

有關赤蘚糖醇發(fā)酵副產物的報道并不多見，報道的主要是甘油［10，14-15］，只有一篇文獻提到副產物中含有核糖醇［15］。另外，文獻中報道微生物合成的多元醇還有阿拉伯糖醇［16］、甘露糖醇［17］、山梨糖醇［18］和木糖醇［19］等。因此，本文選取甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇7種多元醇為標準物質，采用高效液相色譜(HPLC)和液質聯用(LC-MS)對赤蘚糖醇母液的未知糖醇組分進行定性鑒定。

2.2 氨基柱HPLC分析

圖2為7種混合糖醇氨基柱色譜圖?；旌咸谴紭悠泛?種糖醇，采用氨基柱分析，譜圖中只有4個物質峰，保留時間分別為 6.542、7.420 、8.283 和9.331 min，說明混合糖醇樣品中，不同糖醇的保留時間有重疊。對比單一糖醇樣品氨基柱色譜分析結果可知，6.542 min 峰為甘油，7.420 min 峰為赤蘚糖醇;木糖醇、阿拉伯糖醇和核糖醇保留時間相同(均在8.3 min 左右)，因此，8.283 min應為3 種五碳糖醇的疊加峰;甘露糖醇和山梨糖醇保留時間相同，圖2中9.331 min峰應是這兩種六碳糖醇的疊加峰。母液氨基柱色譜圖(圖1)中有3個峰，保留時間分別為7.420、8.277 和 9.260 min，沒有和甘油保留時間相對應的峰，可以確定母液中不含甘油成分;譜圖中7.420 min位置峰與標準赤蘚糖醇對應，確定為赤蘚糖醇成分。母液譜圖中 8.277 min峰(未知峰Ⅰ)與木糖醇、阿拉伯糖醇和核糖醇保留時間基本一致，母液譜圖9.260 min位置峰(未知峰Ⅱ)，與甘露糖醇和山梨糖醇保留時間一致，因為保留時間重疊，因此，僅采用氨基柱HPLC分析，不能將兩未知成分定性。

圖2 混合糖醇標樣的HPLC色譜圖(氨基柱)Fig.2 The HPLC chromatograms of mixed sugar alcohol(NH2column)

2.3 糖分析柱HPLC分析

氨基柱分析結果排除了甘油，而木糖醇、阿拉伯糖醇和核糖醇3種五碳糖醇保留時間與母液中的未知峰Ⅰ一致，甘露糖醇和山梨糖醇兩種六碳糖醇保留時間與母液中未知峰Ⅱ一致，未能將兩未知成分定性。為了進一步區(qū)分阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇，甘露糖醇和山梨糖醇，本文又選用糖分析專用柱(Shodex SC1011)對母液成分進行進一步分析。

母液糖分析柱譜圖如圖3。圖中顯示有3個物質峰，保留時間分別為 10.629、11.01 和 13.107 min。標準糖醇的單一糖分析柱分析保留時間分別為:赤蘚糖醇 11.01 min，阿拉伯糖醇 13.319 min，核糖醇10.587 min，木糖醇 15.964 min，甘露糖醇 13.321 min，山梨糖醇16.532 min。比較母液色譜圖和標準糖醇保留時間可以發(fā)現，母液色譜圖中沒有與木糖醇和山梨糖醇對應的物質峰，因此，可以確定母液中不含木糖醇和山梨糖醇成分，結合氨基柱分析結果，可以初步確定母液中應含有阿拉伯醇和甘露糖醇組分。圖3中峰2與赤蘚糖醇保留時間一致，可以確定為赤蘚糖醇。圖3中峰1保留時間與核糖醇接近，通過外加核糖醇分析，譜圖中(圖4)沒有出現新的色譜峰，而峰1響應值明顯升高，可以推定峰1為核糖醇成分。糖分析柱色譜阿拉伯糖醇和甘露糖醇保留時間非常接近，并且與峰3保留時間基本一致，所以峰3可能是阿拉伯糖醇或甘露糖醇或它們的混合物。

圖3 赤蘚糖醇母液HPLC色譜圖(Shodex SC1011色譜柱)Fig.3 The HPLC chromatograms of mother liquor(Shodex SC1011 column)

圖4 母液外加核糖醇HPLC色譜圖(Shodex SC1011色譜柱)Fig.4 The HPLC chromatograms of mother liquor and ribitol(Shodex SC1011 column)

2.4 母液未知組分定性

母液氨基柱色譜分析，未知峰Ⅰ可能是核糖醇、阿拉伯糖醇或木糖醇一種或幾種，結合糖分析柱色譜結果，可以排除木糖醇的存在。通過比較母液兩柱譜圖(圖1和圖3)，可以發(fā)現未知峰Ⅰ面積遠大于圖3中的核糖醇峰(峰1)，所以未知峰Ⅰ不可能只含有核糖醇成分，應該是核糖醇與阿拉伯糖醇的混合物，并且以阿拉伯糖醇為主。母液氨基柱色譜分析，未知峰Ⅱ可能為山梨糖醇或甘露糖醇或兩者的混合物，而糖分析柱色譜排除了山梨糖醇，所以未知峰Ⅱ應為甘露糖醇。再通過比較兩譜圖中的赤蘚糖醇峰、未知峰Ⅱ(甘露糖醇)和峰3的面積，可以發(fā)現，氨基柱分析母液中甘露糖醇(未知峰Ⅱ)與赤蘚糖醇相當，而糖分析柱分析結果顯示峰3的面積明顯比赤蘚糖醇大，因此，可以推斷峰3應是阿拉伯糖醇和甘露糖醇的混合物。

根據以上分析結果，基本可以推斷赤蘚糖醇母液中的未知糖醇成分主要是阿拉伯糖醇甘露糖醇以及少量的核糖醇。為了進一步驗證HPLC分析結果，本文又采用LC-MS對母液中各組分的分子量進行了測定。

2.5 液質聯(LC-MS)分析

LC-MS分析液相采用氨基柱。圖5為母液質譜總離子流量圖。圖中給出3種物質［M+Na］+信號的質荷比(m/z)分別為 145.035 3、175.058 2 和205.079 4，據此可以推斷出3種物質的分子質量分別為122、152和182，與赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇(核糖醇)和甘露糖醇分子質量一致，進一步證實了HPLC分析結果。另外，圖中質荷比(m/z)為175.0582的主峰(對應分子量為152)左側有小峰，推測主峰應為阿拉伯糖醇，小峰應為核糖醇。

圖5 母液的LC-MS譜圖Fig.5 The LC-MS chromatograms of mother liquor

3 討論

本文通過HPLC以及LC-MS分析對赤蘚糖醇生產母液中的兩種未知成分進行定性鑒定，結果顯示，赤蘚糖醇母液含有的未知糖醇成分主要是阿拉伯糖醇和甘露糖醇，另外，還含有少量的核糖醇。

目前糖和糖醇定性和定量分析主要采用HPLC分析，色譜柱主要選用糖分析柱(陽離子交換柱)［20］和氨基柱［21-22］，檢測器一般為示差折光檢測器。本文采用HPLC分析對赤蘚糖醇生產母液中的未知糖醇成分進行定性鑒定。首先選用氨基柱對赤蘚糖醇母液進行分析，分離出3種主要組分，赤蘚糖醇、五碳糖醇(阿拉伯糖醇、核糖醇、木糖醇)和六碳糖醇(甘露糖醇、山梨糖醇)。因為，同分異構體的五碳糖醇以及六碳糖醇糖在氨基柱的保留時間基本相同，所以單純使用氨基柱未能對母液中的兩種未知成分定性。本文隨后又用糖分析柱(陽離子交換柱)對母液進行了分析，也分離出3種成分，通過與糖醇標準物比較，鑒定出母液中含有核糖醇成分，并排除了木糖醇和山梨糖醇的存在，結合氨基柱分析結果，推斷出母液中的六碳糖醇應為甘露糖醇。最后通過比較兩次分析中核糖醇峰面積與五碳糖醇峰面積，推斷出母液中還應含有阿拉伯糖醇，并且阿拉伯糖醇含量要遠大于核糖醇，質譜分析也佐證了這一結果。通過以上分析可以發(fā)現，因為標準糖醇保留時間有重疊，單獨采用氨基柱或糖柱HPLC分析都未能對赤蘚糖醇母液未知組分進行定性，通過兩色譜柱的分析結果相互印證，以及質譜分子量的測定，才最終完成了對赤蘚糖醇母液未知糖醇的定性鑒定。

本文研究用母液來自赤蘚糖醇的生產企業(yè)。赤蘚糖醇下游提取工藝均為物理過程，過程中不可能產生新的糖醇物質，所以母液中鑒定出的阿拉伯糖醇、甘露糖醇和核糖醇應是赤蘚糖醇發(fā)酵過程中產生的副產物。赤蘚糖醇生產發(fā)酵液HPLC分析(氨基柱)顯示，發(fā)酵液中有少量副產物存在(生產監(jiān)測數據，未列出)，因為副產物含量較低，加之發(fā)酵液成分復雜，直接進行副產物分析鑒定難度較大。而母液是發(fā)酵液經凈化除雜、濃縮結晶分離赤蘚糖醇后剩余的料液，在此過程中這些多元醇副產物經多次濃縮，濃度大幅度提高，同時料液也被徹底凈化，所以采用母液對這些副產物鑒定反而比較容易，特別是核糖醇這樣含量比較少的副產物。

高滲酵母產多元醇的研究最常見的副產物的主要是甘油，赤蘚糖醇發(fā)酵產甘油也有報道［10，14-15］，Lin等研究叢梗孢酵母(Moniliella)赤蘚糖醇發(fā)酵時發(fā)現，副產物中除甘油外還含有核糖醇，副產物產率約占總糖醇產率的1/4［15］。耐高滲酵母以葡萄糖為底物，可以轉化生成阿拉伯糖醇，也常伴有大量甘油副產物［23］。微生物產甘露糖醇主要有乳酸菌和酵母菌［17］，最近有報道耶氏解脂酵母酵母利用甘油為底物，發(fā)現有甘露糖醇副產物［7，24］，但未見有以葡萄糖為底物赤蘚糖醇發(fā)酵產阿拉伯糖醇和甘露糖醇副產物的文獻報道。

本文通過HPLC和LC-MS分析，首次鑒定出赤蘚糖醇生產母液中含有阿拉伯糖醇、甘露糖醇和少量核糖醇，不含其他雜質。這幾種多元糖醇都是食品用多元糖醇常見品種，這為母液資源化開發(fā)利用提供了科學依據。本研究明確了生產中赤蘚糖醇發(fā)酵多元醇副產物的種類和含量，也為今后赤蘚糖醇生產菌株的改良和發(fā)酵效率的提高奠定了理論基礎。

［1］ Munro C，Bernt W O，Borzelleca J F，et al.Erythritol:an interpretive summary of biochemical，metabolic，toxicological and clinical data ［J］.Food and Chemical Toxicol，1998，36(12):1 139-1 174.

［2］ 劉建軍，趙祥穎，田延軍，等.低熱值甜味劑——赤蘚糖醇［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(9):133-135.

［3］ Shindou T，Sasaki Y，Eguchi T，et al.Identification of erythritol by HPLC and GC-MS and quantitative measurement in pulps of various fruits［J］.Agric Food Chem，1989，37(6):1 474-1 476.

［4］ Shindou T，Sasaki Y，Miki H，et al.Determination of erythritol in fermented foods by high performance liquid chromatography［J］.Shokuhin Eiseigaku Zasshi，1988，29(6):419-422.

［5］ Hee-Jung Moon，Marimuthu Jeya，In-Won Kim，et al.Biotechnological production of erythritol and its applications［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，86(4):1 017-1 025.

［6］ Den Hartog G，Boots A，Adam-Perrot A，et al.Erythritol is a sweet antioxidant［J］.Nutrition，2010，26(4):449-458.

［7］ Tomaszewska L，Rywinska A，Gladko wski W.Production of erythritol and mannitol by Yarrowia lipolytica yeast in media containing glycerol［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2012，39(9):1 333-1 343.

［8］ DENG Huihui，HAN Ye，LIU Yuanyuan.Identifi cation of a newly isolated erythritol-producing yeast and cloning of its erythritol reductase genes［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2012，39(11):1 663-1 672.

［9］ 高慧，竇文芳，陸茂林，等.碳源對圓酵母(Torula sp.)B84512發(fā)酵合成赤蘚糖醇及副產物甘油的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(3):17-21.

［10］ YANG Li-Bo，ZHAN Xiao-Bei.A novel osmotic pressure control fed-batch fermentation strategy for improvement of erythritol production by Yarrowia lipolytica from glycerol［J］.Bioresource Technology，2014，151(1):120-127.

［11］ 張立鶴，趙祥穎，張家祥，等.從赤蘚糖醇生產廢棄母液中回收赤蘚糖醇［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(4):24-28.

［12］ 劉建軍，趙祥穎，田延軍，等.利用膜分離技術從發(fā)酵液中分離提純赤蘚糖醇的方法［P］.中國.專利號:CN 101182282A，2008.

［13］ 張惟杰.復合多糖生化研究技術［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1987:4-8.

［14］ 蔡威，張建志，江正強，等.梅利斯叢梗孢酵母發(fā)酵生產赤蘚糖醇的條件優(yōu)化［J］.食品科學.2013，34(21):259-263.

［15］ Shie-Jea Lin，Chiou-Yen Wen，Jian-Ching Liau，et al.Screening and production of erythritol by newly isolated osmophilic yeast-like fungi［J］.Process Biochemistry，2001，36(12):1 249-12 58.

［16］ Onishi H.Studies on osmophilic yeasts.PartⅧ.Polyalcohol production by various genera and species of yeasts［J］.Bull Agric Chem Soc Jpn，1960，24(2):131-140.

［17］ Saha B C，Racine F M.Biotechnological production of mannitol and its applications［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，89(4):879-891.

［18］ Ladero V，Ramos A，Wiersma A，et al.High-level production of the low-calorie sugar sorbitol by Lactobacillus plantarum through metabolic engineering［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73(6):1 864-1 872.

［19］ Prakasham R S，Rao R S，Hobbs P J.Current trends in biotechnological production of xylitol and future prospects［J］.Current Trends in Biotechnology and Pharmacy，2009，3(1):8-36.

［20］ GB/T 22222-2008.食品中木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇的測定高效液相色譜法［S］.

［21］ 施燕支，郭雪清，余啟榮，等.HPLC示差折光分析法測定口香糖中的木糖醇等多種糖醇的含量［J］.首都師范大學學報:自然科學版，2005(1):61-63.

［22］ 李黎，劉玉峰，唐華澄，等.高效液相色譜法測定食品中的糖醇［J］.食品科學，2007，28(6):278-280.

［23］ 李澤，趙祥穎，劉建軍.產D-阿拉伯醇酵母菌株的篩選及鑒定［J］.食品工業(yè)，2012，33(10):27-30.

［24］ Miron czuk A M，Furgala J，Rakicka M，et al.Enhanced production of erythritol by Yarrowia lipolytica on glycerol in repeated batch cultures［J］.J Ind Microbiol Biotechnol.2014，41(1):57-64.