黃鱔肉雙酶水解產(chǎn)物的功能特性及其抗氧化活性*

韓林，丁博，王兆丹，汪開拓，鄭紅，鄭海英

(重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶，404100)

黃鱔(Monopterus albus)，俗稱:鱔魚、鱓魚、羅鱔，屬輻鰭魚綱，合鰓魚目，合鰓魚科，黃鱔屬的淡水底棲肉食性魚類［1］。黃鱔肉嫩味鮮，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值甚高，富含蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，具有補(bǔ)中益血，治虛損、咳嗽、濕熱身癢等功效［2-3］。但目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)黃鱔肉酶解產(chǎn)物的功能性及抗氧化活性研究報(bào)道甚少。常用的酶主要有木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和組織蛋白酶等等，其中胰蛋白酶是由牛、羊、豬胰臟提取而得到的一種肽鏈內(nèi)切酶，最適pH值為7.8～8.5，只能斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。木瓜蛋白酶屬巰基蛋白酶，具有較寬的底物特異性，作用于蛋白質(zhì)中L-精氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸殘基羧參與形成的肽鍵，能切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鏈-CO-NH-生成分子質(zhì)量較小的多肽。堿性蛋白酶是一種最適作用pH為9～11的蛋白酶類，不但能水解肽鍵，還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能，對(duì)切開點(diǎn)羧基側(cè)具有專一性。

本試驗(yàn)以淡水黃鱔肉為原料，采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶及雙酶混合使用對(duì)其進(jìn)行酶解，并檢測(cè)了酶解產(chǎn)物的功能性和抗氧化活性，為黃鱔肉的深入研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、藥品與設(shè)備

黃鱔，購(gòu)于重慶永輝超市。堿性蛋白酶(100 U/mg)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;木瓜蛋白酶(1 000 U/mg)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;胰蛋白酶(500 U/mg)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma公司;2，2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，Amersco公司;甘氨酸，上?？颠_(dá)氨基酸廠;鐵氰化鉀、三氯乙酸、NaOH均為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

AL104電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;5417R冷凍離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司;ALPHA1-2/LD-Plus真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;UEC0905005紫外可見分光光度計(jì)，上海博普達(dá)儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃鱔肉蛋白酶酶解產(chǎn)物的制備工藝

黃鱔肉→洗凈→搗碎→與去離子水混合(質(zhì)量體積比1∶10(g∶mL))→調(diào)溫度、pH后加入蛋白酶酶解→滅酶(100℃，10 min)→離心(10 000 r/min，10 min)→取上清液→真空冷凍干燥→黃鱔肉蛋白酶解產(chǎn)物

其中酶解條件為:酶∶底物 =1∶500，(1)木瓜蛋白酶酶解時(shí)間240 min，pH 7.0，溫度60 ℃;(2)堿性蛋白酶酶解時(shí)間240 min，pH 8.0，溫度50℃;(3)胰蛋白酶酶解時(shí)間240 min，pH 8.0，溫度37℃;(4)木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶先后在各酶適宜的pH和溫度下酶解120 min;(5)堿性蛋白酶和胰蛋白酶先后在各酶適宜的pH和溫度下酶解120 min;(6)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶先后在各酶適宜的pH和溫度下酶解120 min。

1.2.2 水解度的測(cè)定

采用茚三酮比色法［4］。具體操作如下:配制不同濃度(20、40、60、80、100 μg/mL)的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1 mL，加入1 mL蒸餾水，充分混勻，再加入1 mL(質(zhì)量濃度為0.5%)茚三酮溶液，混合均勻后置于沸水浴中加熱15 min，取出立即冷卻，然后用75%乙醇定容至10 mL，在波長(zhǎng)570 nm測(cè)定吸光度，以甘氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.001x+0.017，R2=0.996。

準(zhǔn)確稱取0.01 g各樣品(氨基酸含量大約在20～100 μg)溶解于10 mL蒸餾水中，取1 mL按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法進(jìn)行吸光度的測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中氨基酸的含量，以樣品中氨基酸的含量表示水解度大小［5］。

1.2.3 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 清除 DPPH 自由基的能力［6］

準(zhǔn)確移取3.9 mL質(zhì)量濃度為 25.61 mg/L的DPPH溶液，加入0.1 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，混勻，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)吸光度Ac。將不同水解時(shí)間(0.5、1、2、3、4 h)得到的樣品分別配制成濃度為5 mg/mL的溶液，準(zhǔn)確移取2 mL，加入2 mL DPPH溶液(質(zhì)量濃度為25.61 mg/L)，混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度Ai。同時(shí)測(cè)定3.9 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液中加入0.1 mL不同濃度各樣品溶液的吸光度Aj。DPPH清除率為:

1.2.3.2 清除 ABTS 自由基的能力［7-8］

取5.0mL 7 mmol/L 的 ABTS 溶液，加入88.0 μL 140 mmol/L的過(guò)硫酸鉀，在室溫下置于暗處反應(yīng)12～16 h，形成ABTS自由基儲(chǔ)備液。在734 nm處，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇稀釋ABTS自由基儲(chǔ)備液，備用。不同水解時(shí)間(0.5、1、2、3、4h)得到的樣品分別配制成濃度為5 mg/mL的溶液，準(zhǔn)確移取2 mL，加入2 mL ABTS+溶液，混勻，在室溫下反應(yīng)6 min，于734 nm處測(cè)定吸光度 AE。同時(shí)吸取3.9 mL ABTS+溶液，加入0.1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液于734 nm處測(cè)定吸光度 AB。ABTS自由基清除率按式(2)計(jì)算:

1.2.4 功能特性的測(cè)定

1.2.4.1 溶解性和熱穩(wěn)定性

根據(jù)李雪等的方法測(cè)定［9］。

1.2.4.2 乳化性［10］

準(zhǔn)確稱取各酶解產(chǎn)物0.1 g，溶于10 mL蒸餾水中，用0.2 mol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶解調(diào)節(jié)至中性，在30℃的水浴中保溫10 min，迅速加入等體積的大豆色拉油(10 mL)，充分混合均勻后，在2 500 r/min下離心5 min，按下載計(jì)算乳化能力:

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度

黃鱔肉酶解產(chǎn)物水解度隨時(shí)間的變化如圖1所示。由圖1可以看出，隨著酶解時(shí)間的增加，單酶和雙酶酶解產(chǎn)物的水解度逐漸上升，單酶中以胰蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度上升較快，當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，酶解產(chǎn)物氨基酸含量達(dá)40 μg/mL，而雙酶酶解產(chǎn)物在2 h后，水解度上升較為顯著，尤其是胰蛋白酶+木瓜蛋白酶組合，并且均高于單酶，這可能是由于所使用的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶活相對(duì)較高，在相同時(shí)間內(nèi)對(duì)黃鱔肉酶解更為徹底。因此，雙酶酶解黃鱔肉更具有優(yōu)勢(shì)。

圖1 黃鱔肉酶解產(chǎn)物水解度隨時(shí)間的變化Fig.1 The effect of the time for the degree of the hydrolysis of hydrolysates from Monopterus Albus meat

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH·清除能力

黃鱔肉酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·的清除能力如圖2所示。由圖2可知，雙酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·的清除能力顯著高于單酶酶解產(chǎn)物，主要原因是雙酶酶解黃鱔肉較單酶酶解徹底，產(chǎn)物中可能富含具有抗氧化活性的蛋白多肽，增強(qiáng)了其清除自由基的能力［11-12］。但隨著酶解時(shí)間的增加(3 h后)，各酶解產(chǎn)物清除DPPH·的能力逐漸下降，可能是因?yàn)榧訜崦附鈺r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響了蛋白多肽的抗氧化活性，這與黃條紋鲹蛋白酶解物及蠶蛹蛋白酶解物對(duì)DPPH·的清除規(guī)律相似［14-15］，但花生蛋白酶解物對(duì)DPPH的清除能力則隨水解度的增加而增強(qiáng)［16］，這說(shuō)明水解度對(duì)DPPH·清除能力的影響比較復(fù)雜，與蛋白質(zhì)原料和蛋白酶種類有關(guān)。

圖2 黃鱔肉酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2 The DPPH radical scavenging activity of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

2.2.2 ABTS 自由基清除能力

由圖3可知，黃鱔肉雙酶酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除能力顯著高于單酶酶解產(chǎn)物，特別是胰蛋白酶+木瓜蛋白酶組合，最大清除率可達(dá)81.76%(酶解時(shí)間2h)，這與對(duì)DPPH自由基的清除現(xiàn)象相似。

2.3 功能特性

2.3.1 溶解性

不同條件下黃鱔肉酶解產(chǎn)物的溶解性如圖4所示?？梢钥闯?，隨著酶解時(shí)間的增加，酶解產(chǎn)物的溶解性逐漸增大，其中雙酶酶解產(chǎn)物的溶解性普遍高于73%，顯著高于單酶，特別是木瓜蛋白酶+堿性蛋白酶組合，酶解時(shí)間為4 h時(shí)，酶解產(chǎn)物溶解度達(dá)到96.14%。主要是因?yàn)殡p酶酶解使蛋白質(zhì)大分子電離出更多的親水基團(tuán)和離子基團(tuán)，其數(shù)量與蛋白質(zhì)的水合作用程度有關(guān)［17］。

2.3.2 熱穩(wěn)定性

圖3 黃鱔肉酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除能力Fig.3 The ABTS radical scavenging activity of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

圖4 黃鱔肉酶解產(chǎn)物的溶解性Fig.4 The solubility of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

熱處理常常會(huì)使食品中的蛋白質(zhì)分子發(fā)生構(gòu)象變化和分子間的凝集，導(dǎo)致其功能特性降低，因此酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性是衡量其是否適用于食品加工的一個(gè)重要指標(biāo)［18］。黃鱔肉酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性如圖5所示?？梢钥闯?，黃鱔肉酶解產(chǎn)物經(jīng)93℃處理10 min后溶解性均略有下降，但熱穩(wěn)定性仍然良好，其中雙酶酶解產(chǎn)物熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于單酶酶解產(chǎn)物。

2.3.3 乳化性

乳化性是蛋白質(zhì)重要的功能特性，對(duì)其用于食品乳化劑中具有重要的意義。蛋白質(zhì)分子的乳化性主要受分子質(zhì)量、疏水基團(tuán)的數(shù)目以及蛋白質(zhì)的彈性和分子結(jié)構(gòu)等影響［17］。黃鱔肉酶解產(chǎn)物的乳化性如圖6所示。隨著酶解時(shí)間的增加，黃鱔肉酶解產(chǎn)物的乳化性均逐步下降，雙酶酶解產(chǎn)物的乳化性下降尤為顯著，主要原因是當(dāng)水解程度過(guò)大時(shí)，水解產(chǎn)物中小分子的肽和氨基酸增多，不利于蛋白質(zhì)在油-水界面的擴(kuò)散和吸附，而形成具有適宜厚度和流變性的蛋白膜［19］。

圖5 黃鱔肉酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性Fig.5 The heat stability of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

圖6 黃鱔肉酶解產(chǎn)物的乳化性Fig.6 The emulsibility of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

3 結(jié)論

(1)黃鱔肉蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度和抗氧化活性受酶解時(shí)間和蛋白酶種類的影響，其中雙酶酶解產(chǎn)物抗氧化活性強(qiáng)于單酶酶解產(chǎn)物，其中胰蛋白酶+木瓜蛋白酶組合酶解產(chǎn)物抗氧化活性最強(qiáng)，對(duì)DPPH和ABTS自由基最大清除率可達(dá)62.18%和81.76%。

(2)黃鱔肉雙酶酶解產(chǎn)物在溶解性和熱穩(wěn)定性方面優(yōu)于單酶酶解產(chǎn)物，而在乳化性方面則較差，并且酶解時(shí)間對(duì)黃鱔肉酶解產(chǎn)物的功能性影響較大。當(dāng)酶解時(shí)間為3h時(shí)，得到的酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性和功能性質(zhì)，特別是胰蛋白酶+木瓜蛋白酶組合。因此，可以考慮取該條件下的酶解產(chǎn)物制備抗氧化活性多肽應(yīng)用于食品工業(yè)。

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