如何改善卵母細胞質(zhì)量

譚美玲，莊廣倫

（中山大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣州 510080）

在IVF 助孕過程中，有相當一部分高齡、反復種植失敗或反復流產(chǎn)的患者，卵母細胞質(zhì)量是影響其妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素。要改善這類患者的妊娠結(jié)局，關(guān)鍵在于改善卵母細胞質(zhì)量以獲得有良好發(fā)育潛能的胚胎。卵母細胞質(zhì)量與年齡密切相關(guān)，隨年齡增長，卵巢儲備下降的同時，卵母細胞質(zhì)量也相應變差。此外，卵母細胞質(zhì)量還與遺傳、免疫、內(nèi)分泌代謝、超排卵等有關(guān)。有關(guān)卵母細胞的發(fā)生和卵泡發(fā)育的過程非常復雜，其中，對卵母細胞線粒體作用的研究備受關(guān)注。通過增加卵母細胞線粒體而改善卵母細胞質(zhì)量，在臨床實踐中已有相關(guān)研究。

一、卵母細胞質(zhì)量的影響因素

1.高齡與卵母細胞質(zhì)量下降：高齡女性的卵母細胞質(zhì)量下降是公認的事實，而卵母細胞質(zhì)量是妊娠成功與否的關(guān)鍵因素，導致女性生育力隨年齡增加而下降［1］。線粒體的能量產(chǎn)生與線粒體DNA 存在惡性循環(huán)，線粒體能量產(chǎn)生過程中釋放大量氧自由基，高齡婦女的抗氧化能力下降，自由基減少，活性氧（ROS）堆積，供能的三磷酸腺苷（ATP）減少，導致卵母細胞減數(shù)分裂過程中染色體分離障礙，形成非整倍體胚胎，而非整倍體胚胎是反復種植失敗和反復流產(chǎn)的主要因素［2-3］。

2.超排卵與卵母細胞質(zhì)量：無論是外源性還是內(nèi)源性Gn升高，均可能導致非整倍體的產(chǎn)生。與自然生殖過程相比，IVF存在低妊娠率和高流產(chǎn)率，32%～64%的胚胎出現(xiàn)染色體異常，可能與超排卵過程中超生理水平的雌激素以及高劑量FSH 的應用對卵母細胞質(zhì)量產(chǎn)生的影響有關(guān)［4-5］。超排卵時高劑量FSH 可影響卵母細胞第一次減數(shù)分裂時微管和紡錘體完整性，導致非整倍體卵母細胞、胚胎增加，使種植失敗和流產(chǎn)增加［6-8］。因此，近年來提出對于高齡、卵巢儲備差的婦女推薦微刺激方案，減少Gn劑量，從而獲得少而優(yōu)的卵母細胞，提高妊娠率。

3.免疫異常與卵母細胞質(zhì)量：1989年，Gleicher等［9］首次提出“自身免疫生殖失敗綜合癥”這一概念，患者主要表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜異位癥、不孕、自身抗體升高。自身抗體是指免疫系統(tǒng)針對自身組織，器官、細胞及細胞成分產(chǎn)生的抗體。如果自身抗體的滴度超過正常水平，就可能對身體產(chǎn)生損傷，誘發(fā)疾病。自身免疫性疾病中有許多自身抗體，其中與IVF結(jié)局最密切相關(guān)的是抗核抗體、抗心磷脂抗體、抗甲狀腺抗體等，這些抗體升高與早期自發(fā)性流產(chǎn)、反復種植失敗等有關(guān)［10-12］。多個研究發(fā)現(xiàn)自身抗體陽性患者的成熟卵母細胞率、胚胎卵裂率較陰性患者低，提示自身抗體可影響卵母細胞和胚胎的發(fā)育潛能［13-14］。

4.影響卵母細胞質(zhì)量的遺傳因素：卵巢功能早衰（POF）患者卵母細胞數(shù)目減少的同時質(zhì)量下降。FSH、FSHR、LH、LHR、CYP17、CYP19 等激素合成相關(guān)基因的突變可影響卵泡功能和卵母細胞質(zhì)量［15］。近年來研究較多的與卵泡發(fā)育和成熟相關(guān)的是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP15）。BMP15是卵母細胞來源的轉(zhuǎn)化生長因子，促進卵泡發(fā)育和成熟，調(diào)節(jié)顆粒細胞對FSH 的敏感性，提高卵母細胞的發(fā)育潛能。在控制性卵巢刺激（COS）中，甚至可作為卵巢反應或卵母細胞質(zhì)量的標志物。BMP15的突變與卵 巢 功 能 減 退（premature ovarian insufficiency，POI）、卵母細胞質(zhì)量下降有關(guān)［16］。

5.代謝異常與卵母細胞質(zhì)量下降：肥胖、糖尿病、多囊卵巢綜合征（PCOS）等內(nèi)分泌代謝異?；颊叩穆涯讣毎l(fā)育潛能受損。動物研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠的卵丘復合物細胞內(nèi)脂質(zhì)升高、紡錘體異常、線粒體膜功能異常，體外受精后形成的胚胎發(fā)育潛能受損、囊胚內(nèi)線粒體含量下降［17］。糖尿病小鼠的高血糖濃度可抑制卵母細胞減數(shù)分裂的恢復使卵母細胞質(zhì)量下降、種植前胚胎退化［18］。育齡婦女中PCOS的發(fā)病率約為5%～10%，患者往往伴隨代謝異常綜合征，包括高雄激素血癥、胰島素抵抗、2 型糖尿病等。盡管PCOS患者的獲卵數(shù)較多，但受精率、卵裂率低，流產(chǎn)率高。其卵母細胞質(zhì)量下降可能與雄激素導致卵母細胞內(nèi)線粒體DNA 拷貝數(shù)、線粒體膜功能受損等有關(guān)［19-20］。

二、線粒體與卵母細胞質(zhì)量

1.線粒體：線粒體是真核細胞中含量最豐富的一種較大的細胞器，光學顯微鏡下觀察呈“短線狀”或“顆粒狀”，因形態(tài)學特征而得名為線粒體，也是動物細胞中唯一含有DNA 的細胞器［21］。在單個人類卵母細胞中，線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)約為20 000～800 000，mtDNA 的拷貝數(shù)可間接反映細胞內(nèi)線粒體的數(shù)量［22］。線粒體的主要功能是作為細胞的“能量工廠”，通過有氧呼吸產(chǎn)生ATP，提供細胞生命活動所需的能量。線粒體還可儲存鈣離子，參與類固醇合成和細胞衰老的過程［23］。

2.線粒體與卵母細胞發(fā)生和發(fā)育：卵母細胞的成熟過程，需要足夠的能量供給。在卵泡發(fā)育過程中，能量需求逐漸升高，在排卵階段達到頂峰。與逐漸增高的能量需求相對應，細胞內(nèi)的mtDNA 數(shù)量逐漸增加，直到Graff卵泡階段達到峰值。在人類所有細胞中，成熟卵母細胞內(nèi)具有最大量的mtDNA。減數(shù)分裂是一個高能耗的過程。在分裂過程中，不僅線粒體的形態(tài)和數(shù)量發(fā)生變化，線粒體的分布發(fā)生相應變化。線粒體漸趨于向紡錘體靠攏，為染色體分離時微管活動提供能量。

mtDNA 的數(shù)量下降會直接影響卵母細胞的受精能力，同時也是評價卵母細胞質(zhì)量的重要標志物。Santos等［3］的研究顯示正常受精的人類卵母細胞內(nèi)mtDNA 平均拷貝數(shù)顯著高于受精失敗的卵母細胞，退化卵母細胞內(nèi)mtDNA 拷貝數(shù)也較少。

3.自體線粒體移植與輔助生育技術(shù)：由高齡、過度肥胖、2型糖尿病以及其他遺傳因素所導致的線粒體功能下降最終進一步表現(xiàn)為卵母細胞質(zhì)量的下降和臨床妊娠的失敗，這已經(jīng)成為輔助生殖過程中極具挑戰(zhàn)性的課題。目前，專家們在探索不同的治療方案，總結(jié)起來，大致可以分為線粒體替代治療和線粒體活化劑兩大類。

替代治療包括線粒體或胞漿移植、原核移植、紡錘體移植和極體移植。其中，目前取得較大進展的是線粒體移 植。20 世 紀90 年 代 中 期Cohen 等［24］開始嘗試使用胞漿移植的方式，將供體提供的年輕線粒體通過胞漿移植轉(zhuǎn)移到線粒體功能異常的卵母細胞中，幫助卵母細胞獲得優(yōu)質(zhì)的線粒體，改善臨床結(jié)局。此項技術(shù)迅速引起了人們的關(guān)注，后來，在意識到異質(zhì)化帶來的問題后，該項技術(shù)的研究熱度也開始下降。但是，最近報道的自體生殖系干細胞線粒體移植（AUGMENT IVF）的成功應用又重新燃起了對線粒體移植的研究熱情。通過自體線粒體的移植，最大限度避免異質(zhì)化帶來風險的同時改善卵母細胞質(zhì)量，給高齡、卵母細胞質(zhì)量差的患者帶來了新希望。2015年初，英國在全球率先立法允許線粒體移植，給希望得到健康嬰兒的家庭帶來了“黑暗隧道盡頭的一縷陽光”［25］。

三、改善卵母細胞質(zhì)量的方法

1.生長激素（GH）輔助治療改善卵母細胞質(zhì)量：IVF促排卵中添加生長激素可提高低反應患者的妊娠率和活產(chǎn)率，主要是通過改善卵母細胞質(zhì)量。生長激素可增加卵母細胞內(nèi)功能性線粒體的數(shù)量，改善卵巢老化過程中顆粒細胞FSH、LH、GH 受體的表達，減弱BMP 作用，改善卵泡選擇和成熟，減少卵細胞調(diào)亡［26-29］。

2.其他輔助治療［輔酶Q10、脫氫表雄酮（DHEA）］：目前探索應用于改善卵母細胞質(zhì)量的輔助治療還包括DHEA、輔酶Q10 等。DHEA 是卵巢和腎上腺激素合成過程的重要中間產(chǎn)物，近年來廣泛應用于IVF 低反應患者的輔助治療。盡管臨床試驗結(jié)果表明DHEA 不能增加低反應患者的獲卵數(shù)，卻能提高種植率和持續(xù)妊娠率，提示DHEA可改善卵母細胞和胚胎質(zhì)量［30］。正如前述，卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育所需的能量完全依賴于線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP。輔酶Q10 作為一種“線粒體營養(yǎng)物”，可保護線粒體不受氧化損傷，增加卵母細胞線粒體ATP合成，減少ROS水平，這有助于減少非整倍體卵母細胞的產(chǎn)生［31］。

四、展望體外激活（IVA）治療

近年來，Suzuki等［32］提出對POI患者采用卵巢組織體外激活治療（in vitro activation，IVA）。機制仍未十分清楚，但是有觀點認為卵巢內(nèi)存在控制卵泡發(fā)育的相關(guān)抑制因子，導致卵泡在體內(nèi)發(fā)育停止。一旦原始卵泡離開卵巢的微環(huán)境，在體外使用Akt激活因子，可恢復卵泡的活性，移植回體內(nèi)再予以超排，最終可獲得成熟卵母細胞并妊娠。目前國內(nèi)外均已有報道成功案例，為POI患者帶來助孕的新希望，結(jié)果讓人們進一步認識和研究卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育內(nèi)環(huán)境的微調(diào)控！

［1］ Navot D，Bergh PA，Williams MA，et al.Poor oocyte quality rather than implantation failure as a cause of age-related decline in female fertility［J］.Lancet，1991，337：1375-1377.

［2］ de Bruin JP，Dorland M，Spek ER，et al.Age-related changes in the ultrastructure of the resting follicle pool in human ovaries［J］.Biol Reprod，2004，70：419-424.

［3］ Santos TA，El Shourbagy S，St John JC.Mitochondrial content reflects oocyte variability and fertilization outcome［J］.Fertil Steril，2006，85：584-591.

［4］ Dursun P，Gultekin M，Yuce K，et al.What is the underlying cause of aneuploidy associated with increasing maternal age？Is it associated with elevated levels of gonadotropins？［J］.Med Hypotheses，2006，66：143-147.

［5］ Baart EB，Martini E，van den Berg I，et al.Preimplantation genetic screening reveals a high incidence of aneuploidy mosaicism in embryos from young women undergoing IVF［J］.Hum Reprod，2006，21：223-233.

［6］ Xu YW，Peng YT，Wang B，et al.High follicle-stimulating hormone increases aneuploidy in human oocytes matured in vitro［J］.Fertil Steril，2011，95：99-104.

［7］ Hansen M，Kurinczuk JJ，Bower C，et al.The risk of major birth defects after intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization［J］.N Engl J Med，2002，346：725-730.

［8］ Roberts R，Iatropoulou A，Ciantar D，et al.Folliclestimulating hormone affects metaphase I chromosome alignment and increases aneuploidy in mouse oocytes matured in vitro［J］.Biol Reprod，2005，72：107-118.

［9］ Gleicher N，El Roeity A，Confino E，et al.Reproductive failure because of autoantibodies：unexplained infertility and pregnancy wastage［J］.Am J Obstet Gynecol，1989，160：1307-1385.

［10］ Birkenfeld A，Mukaida T，Minichiello L，et al.Incidence of autoimmune antibodies in failed embryo transfer cycles［J］.Am J Reprod Immunol，1994，31（2-3）：65-68.

［11］ Zhong YP，Ying Y，Wu HT，et al.Relationship between antithyroid antibody and pregnancy outcome following in vitro fertilization and embryo transfer［J］.Int J Med Sci，2012，9：121-125.

［12］ Ying Y，Zhong YP，Zhou CQ，et al.A further exploration of the impact of antinuclear antibodies on in vitro fertilizationembryo transfer outcome［J］.Am J Reprod Immunol，2013，70：221-229.

［13］ Shirota K，Nagata Y，Honjou K，et al.Involvement of anticentromere antibody in interference with oocyte meiosis and embryo cleavage［J］.Fertil Steril，2011，95：2729-2731.

［14］ Ying Y，Zhong YP，Zhou CQ.Antinuclear antibodies predicts a poor IVF-ET outcome：impaired egg and embryo development and reduced pregnancy rate［J］.Immunol Invest，2012，41：458-468.

［15］ Sükür YE，KIvan?lI IB，Ozmen B.Ovarian aging and premature ovarian failure［J］.J Turk Ger Gynecol Assoc，2014，15：190-196.

［16］ Persani L，Rossetti R，Di Pasquale E，et al.The fundamental role of bone morphogenetic protein 15in ovarian function and its involvement in female fertility disorders［J］.Hum Reprod Update，2014，20：869-883.

［17］ Wu LL，Russell DL，Wong SL，et al.Mitochondrial dysfunction in oocytes of obese mothers：transmission to offspring and reversal by pharmacological endoplasmic reticulum stress inhibitors［J］.Development，2015，142：681-691.

［18］ Ma JY，Li M，Ge ZJ，et al.Whole transcriptome analysis of the effects of type I diabetes on mouse oocytes［OL］.PLoS One，2012，7（7）：e41981.

［19］ Qiao J，F(xiàn)eng HL.Extra-and intra-ovarian factors in polycystic ovary syndrome：impact on oocyte maturation and embryo developmental competence［J］.Hum Reprod Update，2011，17：17-33.

［20］ Huang Y，Yu Y，Gao J，et al.Impaired oocyte quality induced by dehydroepiandrosterone is partially rescued by metformin treatment［OL］.PLoS One，2015，10（3）：e0122370.

［21］ Van Blerkom J.Mitochondria in human oogenesis and preimplantation embryogenesis：engines of metabolism，ionic regulation and developmental competence［J］.Reproduction，2004，128：269-280.

［22］ Reynier P，May-Panloup P，Chrétien MF，et al.Mitochondrial DNA content affects the fertilizability of human oocytes［J］.Mol Hum Reprod，2001，7：425-429.

［23］ Wilding M.Potential long-term risks associated with maternal aging（the role of the mitochondria）［J］.Fertil Steril，2015，103：1397-1401.

［24］ Cohen J，Scott R，Alikani M，et al.Ooplasmic transfer in mature human oocytes［J］.Mol Hum Reprod，1998，4：269-280.

［25］ Wise J.Mitochondrial donation is “not unsafe”，review confirms［J］.BMJ，2014，348：g3723.

［26］ Kolibianakis EM，Venetis CA，Diedrich K，et al.Addition of growth hormone to gonadotrophins in ovarian stimulation of poor responders treated by in-vitro fertilization：a systematic review and meta-analysis［J］.Hum Reprod Update，2009，15：613-622.

［27］ Yovich JL，Stanger JD.Growth hormone supplementation improves implantation and pregnancy productivity rates for poor-prognosis patients undertaking IVF［J／OL］.Reprod Biomed Online，2010，21：37-49.

［28］ Weall BM，Al-Samerria S，Conceicao J，et al.A direct action for GH in improvement of oocyte quality in poor-responder patients［J］.Reproduction，2015，149：147-154.

［29］ Regan S，Stanger J，Yovich JL，et al.Growth hormone increase gonadotropin receptor in poor-prognosis patients［J］.Hum Reprod，2012，27：525.

［30］ Xu B，Li Z，Yue J，et al.Effect of dehydroepiandrosterone administration in patients with poor ovarian response according to the Bologna criteria［OL］.PLoS One，2014，9（6）：e99858.

［31］ Burstein E，Perumalsamy A，Bentov Y，et al.Co-enzyme Q10 supplementation improves ovarian response and mitochondrial function in aged mice［J］.Fertil Steril，2009，92（3suppl 1）：S31.

［32］ Suzuki N，Yoshioka N，Takae S，et al.Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency［J］.Hum Reprod，2015，30：608-615.