口腔鱗癌組織中Slug表達(dá)及意義

陳友興，馮紅超，宋宇峰，舒敏(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng)550004;貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院;貴州省食品藥品監(jiān)督局)

口腔鱗癌組織中Slug表達(dá)及意義

陳友興1，馮紅超2，宋宇峰3，舒敏1
(1貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng)550004;2貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院;3貴州省食品藥品監(jiān)督局)

摘要:目的觀察鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Slug)在口腔鱗癌(OSCC)組織中的表達(dá)變化，分析其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)特征性蛋白E-鈣黏蛋白(E-cad)和波形蛋白(Vimentin)的關(guān)系，探討Slug在EMT中的作用。方法采用免疫組織化學(xué)法和原位雜交法檢測(cè)42例OSCC組織(觀察組)及12例正?？谇火つそM織(對(duì)照組)中Slug、E-cad、Vimentin的表達(dá)，比較Slug在兩組中表達(dá)的差異性，分析Slug與E-cad及Vimentin的相關(guān)性、Slug與OSCC臨床病理因素的相關(guān)性。結(jié)果觀察組Slug的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P＜0.01) ; Slug在OSCC組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤病理分級(jí)有關(guān)(P均＜0.05)，與OSCC發(fā)病年齡無關(guān); Slug與E-cad的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－3.19，P＜0.05)，Slug與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.264，P＜0.05)。結(jié)論OSCC組織中Slug表達(dá)明顯上調(diào)，并與E-cad、Vimentin具有相關(guān)性，在EMT中具有重要作用，參與了OSCC的發(fā)生、分化及轉(zhuǎn)移過程。

關(guān)鍵詞:口腔鱗癌;鋅指轉(zhuǎn)錄因子;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;免疫組織化學(xué);原位雜交

口腔鱗癌(OSCC)是一種宿主易感性與多病因相互作用的一種多過程疾病，與煙草、乙醇、咀嚼檳榔及存在其他呼吸道癌和消化道癌等有關(guān)［1］。在惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)機(jī)制起關(guān)鍵作用。EMT能夠使具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞，并獲得高侵襲性和轉(zhuǎn)移的能力［2］。鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Slug)是Snail家族成員，是EMT的重要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)往往提示患者預(yù)后較差［3］。E-鈣黏蛋白(E-cad)和波形蛋白(Vimentin)是EMT的特征性蛋白，二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究從蛋白質(zhì)和mRNA水平檢測(cè)OSCC組織中Slug的表達(dá)，分析Slug的表達(dá)與臨床病理因素及E-cad、Vimentin表達(dá)的關(guān)系，探討Slug因子在EMT中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2008～2014年貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院收治的OSCC患者42例(觀察組)，其中男25例、女17例，年齡33～78歲、平均59.3歲。均經(jīng)手術(shù)病理檢查證實(shí)，術(shù)前未行放化療、內(nèi)分泌及生物治療。臨床分期Ⅰ期7例，Ⅱ期8例，Ⅲ期19、Ⅳ期8例;分化程度:高分化26例，中低分化16例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。另外選擇無煙酒嗜好的外傷或正畸拔牙患者12例作為對(duì)照(對(duì)照組)，其性別、年齡與觀察組具有可比性。

1.2Slug蛋白、E-cad、Vimentin檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)法。取觀察組手術(shù)切除的腫瘤組織和對(duì)照組正?？谇火つそM織，10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸高壓熱修復(fù)，加入一抗，4℃過夜，PBS浸洗，加入二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。用已知陽(yáng)性的卵巢癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。兔抗人Slug單克隆抗體購(gòu)自博奧森生物(濃度1∶150)，鼠抗人E-cad/vimentin單克隆抗體(濃度1∶100)、二抗免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉公司。

1.3Slug mRNA檢測(cè)采用原位雜交法。石蠟切片復(fù)溫、常規(guī)脫蠟至水。3% H2O2室溫作用10 min，蒸餾水洗3次，胃蛋白酶室溫消化，暴露mRNA核酸片段，加入固定液室溫固定10 min;蒸餾水洗3次，滴加預(yù)雜交液，濕盒放入40℃恒溫箱中4 h，滴加雜交液，38～42℃恒溫箱過夜，依次用37℃預(yù)溫的2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC沖洗，滴加封閉液，37℃孵育30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃孵育60 min，滴加生物素過氧化物酶，37℃孵育20 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替雜交液作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定

1.4.1人工計(jì)分法光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化和原位雜交后組織標(biāo)本的著色程度。Slug蛋白陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)，Slug mRNA主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，著色為棕黃色; Vimentin陽(yáng)性信號(hào)定位于胞質(zhì)內(nèi)，呈清晰棕黃色顆粒。E-cadherin蛋白陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞膜，于腫瘤細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核表達(dá)＞10%，稱為異位表達(dá);不表達(dá)或細(xì)胞膜表達(dá)＜10%稱為細(xì)胞膜表達(dá)缺失。異位表達(dá)和細(xì)胞膜表達(dá)缺失統(tǒng)稱為陽(yáng)性表達(dá)，單純細(xì)胞膜表達(dá)定義為陰性表達(dá)。每例切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，分別按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分和染色強(qiáng)度計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1～25%為1分，26%～50% 為2分，51%～75%為4分，＞75%為4分;無著色為0分，弱陽(yáng)性為1分，強(qiáng)陽(yáng)性為2分。以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)積分乘以染色強(qiáng)度積分，乘積≥3分為陽(yáng)性，＜3分為陰性。

1.4.2圖像分析法取免疫組織化學(xué)和原位雜交法染色的切片，隨機(jī)選取5個(gè)陽(yáng)性視野，用Imagepro-plus6.0圖像分析系統(tǒng)分別檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度和感興趣區(qū)域(AOI)面積，計(jì)算平均光密度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用四格表χ2或FISH法檢驗(yàn)，組間比較采用配對(duì)t或t'檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組Slug、E-cad、Vimentin表達(dá)情況Slug蛋白:觀察組陽(yáng)性29例(69.0%)，明顯高于對(duì)照組的3例(25.0%)，P＜0.01。E-cad:觀察組陽(yáng)性18例(42.9%)，明顯低于對(duì)照組的12例(100%)，P＜0.01。Vimentin:觀察組陽(yáng)性30例(71.4%)，明顯高于對(duì)照組的2例(16.7%)，P＜0.05; Slug mRNA:觀察組陽(yáng)性25例(59.5%)，明顯高于對(duì)照組的1 例(8.3%)，P＜0.05。

2.2兩組Slug、E-cad、Vimentin平均光密度值觀察組Slug和Vimentin的平均光密度值均高于對(duì)照組，E-cad低于對(duì)照組(P均＜0.05)。見表1。

表1　兩組Slug、E-cad、Vimentin平均光密度值比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別　n Slug　E-cadherin　Vimentin觀察組　42　0.264±0.083*0.187±0.048*0.210±0.055*對(duì)照組12　0.204±0.026　0.265±0.082　0.161±0.009

2.3OSCC組織中E-cad與Slug表達(dá)的關(guān)系相關(guān)性分析顯示，E-cad與Slug在OSCC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－3.19，P＜0.05)，Vimentin與Slug的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.264，P＜0.05)。

2.4Slug的表達(dá)與OSCC臨床病理因素的關(guān)系OSCC組織中Slug的表達(dá)與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有關(guān)(P＜0.05)，與OSCC發(fā)病年齡無關(guān)。見表2。

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，Slug作為一種抗凋亡劑，參與對(duì)乳腺癌局部浸潤(rùn)的維護(hù)，使腫瘤得以生長(zhǎng)，并對(duì)放療產(chǎn)生失敏感性［4］。對(duì)人類胚胎干細(xì)胞進(jìn)行體外分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Slug能夠抑制E-cad表達(dá)，促進(jìn)Vimentin和基質(zhì)金屬蛋白酶增加［5］，這與上皮源性的腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制類似。本研究采用免疫組化方法觀察觀察組中Slug的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，其陽(yáng)性表達(dá)率為78.6% (29/42)，明顯高于對(duì)照組，與原位雜交法所得mRNA的表達(dá)變化一致。Slug主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，在少量唾液腺導(dǎo)管上皮中也可見陽(yáng)性表達(dá)，說明在OSCC組織中，Slug可能主要由腫瘤細(xì)胞、導(dǎo)管上皮細(xì)胞等分泌產(chǎn)生，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中某些生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究顯示，Slug在觀察組中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，并且與腫瘤的病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，它是一個(gè)高度保守的過程，能夠使靜止的上皮細(xì)胞極性消失，失去緊密連接，突破基底膜，成為具有遷移能力的間充質(zhì)細(xì)胞，在上皮源性癌的空間轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用［6］。E-cad是EMT重要的標(biāo)志蛋白，研究顯示，E-cad表達(dá)與OSCC的組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)，提示E-cad作為一個(gè)結(jié)構(gòu)性的關(guān)聯(lián)，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［7］。Vimentin是所有中間纖維分布最廣的蛋白質(zhì)，在正常的間充質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，具有維持細(xì)胞完整性和抗應(yīng)力的作用。E-cad與Vimentin是EMT的特征性蛋白，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［8］。Vimentin在各種上皮性癌中都有表達(dá)，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌等［9～11］，其過表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲密切相關(guān)。本研究顯示，Slug與E-cad、Vimentin分別呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系，表明Slug一定程度上參與了EMT的過程，其可能通過上調(diào)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，使之容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離并向遠(yuǎn)處定植這一過程是通過局部浸潤(rùn)、血行轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖等步驟來實(shí)現(xiàn)的［12］。在OSCC的發(fā)生發(fā)展中，Slug的表達(dá)與E-cadherin、Vimentin具有一定的相關(guān)性，在EMT中具有重要作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

［1］趙世祿，程福強(qiáng)，史繁華.口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床流行病學(xué)研究現(xiàn)狀［J］.2013(04) : 1648-49.

［2］Lee JM，Dedhar S，Kalluri R，et al.The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling，development，and disease ［J］.Cell Biol，2006，172(7) : 973-981.

［3］Merikallio H，T TT，P?kkitaro P，et al.Slug is associated with poor survival in squamous cell carcinoma of the lung［J］.Clin Exp Pathol，2014，7(9) : 5846-5854.

［4］Còme C，Arnoux V，Bibeau F，et al.Roles of the transcription factors snail and slug during mammary morphogenesis and breast carcinoma progression［J］.Mammary Gland Biol Neoplasia，2004，9 (2) : 183-193.

［5］Eastham AM，Spencer H，Soncin F，et al.Epithelial-mesenchymal transition events during human embryonic stem cell differentiation［J］.Cancer Res，2007，67(23) : 11254-11262.

［6］Ombrato L，Malanchi I.The EMT universe: space between cancer cell dissemination and metastasis initiation［J］.Crit Rev Oncog，2014，19(5) : 349-361.

［7］Zaid KW.Immunohistochemical Assessment of E-cadherin and βcatenin in the Histological Differentiations of Oral Squamous Cell Carcinoma［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(20) : 8847-8853.

［8］Havel LS，Kline ER，Salgueiro AM，et al.Vimentin regulates lung cancer cell adhesion through a VAV2-Rac1 pathway to control focal adhesion kinase activity［J］.Oncogene，2015，34(15) :1979-1990.

［9］Burch TC，Watson MT，Nyalwidhe JO，et al.Variable metastatic potentials correlate with differential plectin and vimentin expression in syngeneic androgen independent prostate cancer cells［J］.PLoS One，2013，8(5) : 65005.

［10］Baldwin LA，Hoff JT，Lefringhouse J，et al.CD151-α3β1 integrin complexes suppress ovarian tumor growth by repressing slug-mediated EMT and canonical Wnt signaling［J］.Oncotarget，2014，5 (23) : 12203-12217.

［11］Kim KH，Kim L，Choi S，et al.The clinicopathological significance of epithelial mesenchymal transition associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Korean J Pathol，2014，48(4) : 263-269.

［12］廖子君，雷光焰.腫瘤轉(zhuǎn)移學(xué)［M］.陜西:陜西科學(xué)技術(shù)出版社，2007: 14-18.

(收稿日期:2014-12-07)

通信作者:馮紅超

基金項(xiàng)目:貴陽(yáng)市衛(wèi)生局科技計(jì)劃項(xiàng)目［筑衛(wèi)科技合同字(2014)第15號(hào)］。

文章編號(hào):1002-266X(2015)18-0070-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R739.8

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.026