多能干細(xì)胞體外定向分化生殖細(xì)胞的研究進(jìn)展

王宇晴，姚汝強(qiáng)，張?jiān)粕?天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院，天津300100)

多能干細(xì)胞體外定向分化生殖細(xì)胞的研究進(jìn)展

王宇晴，姚汝強(qiáng)，張?jiān)粕?br/>(天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院，天津300100)

摘要:生殖細(xì)胞缺失造成的不孕不育目前尚無治愈手段。胚胎干細(xì)胞(ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)體外定向分化研究的進(jìn)步為體外生成生殖細(xì)胞提供了新途徑。胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞經(jīng)由外胚層樣細(xì)胞(Epi-LCs)能被誘導(dǎo)成為原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(PGCLCs)。這些原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞具有正常的生精/卵以及繁殖功能?，F(xiàn)將小鼠及人類ESCs和iPSCs向生殖細(xì)胞分化的研究進(jìn)行綜述，為解決生精/卵障礙的不孕問題提供新的思路。

關(guān)鍵詞:不孕不育癥;胚胎干細(xì)胞;誘導(dǎo)多能干細(xì)胞;原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞

生殖細(xì)胞的一個(gè)重要特點(diǎn)是能夠進(jìn)行減數(shù)分裂并生成單倍體配子，從而使其遺傳物質(zhì)減半。配子質(zhì)量較差或較少是導(dǎo)致不孕不育的主要原因。輔助生殖技術(shù)為不孕不育患者帶來了希望，但體外受精技術(shù)也要求提供有效的生殖細(xì)胞即配子。因此對無功能性生殖細(xì)胞的男性或女性來說，在體外培養(yǎng)出配子將是克服不孕不育的一個(gè)新途徑。人類的多能干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞(ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)能夠提供體外研究生殖細(xì)胞發(fā)育的模型。已有文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠以及人類ESCs和iPSCs在體外培養(yǎng)條件下可向生殖細(xì)胞分化，一些小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化形成的成熟單倍體精子細(xì)胞具有使卵子受精并產(chǎn)生活的后代的能力［1］?，F(xiàn)將ESCs和iPSCs向生殖細(xì)胞分化的研究現(xiàn)狀綜述如下。

1　多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞的定向分化

1.1多能干細(xì)胞的特點(diǎn)多能干細(xì)胞具有兩個(gè)基本特點(diǎn):一是自我更新，即能夠在增殖的同時(shí)保持分化潛能;二是全能性，即能夠分化為原腸腔三個(gè)胚層所有的細(xì)胞類型。多能干細(xì)胞能夠分化為生殖細(xì)胞系。源于胚胎細(xì)胞的人胚胎干細(xì)胞(hESCs)以及源于原始生殖細(xì)胞(PGCs)的人胚胎生殖細(xì)胞(hEGCs)最初發(fā)現(xiàn)于1998年［2］。此后人們便開始嘗試重新編程體細(xì)胞以得到體外iPSCs。2006年，Takahashi等首次通過將慢病毒介導(dǎo)的四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc轉(zhuǎn)入小鼠纖維原細(xì)胞，獲得小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(miPSCs)［3］。2007年，人們通過將轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc或Oct3/4、Sox2、Nanog由慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)入人纖維原細(xì)胞，獲得人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)［4］。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)重新編程獲得的hiPSCs與hESCs一樣，能夠在體外定向分化為早期PGCs。不管是在體內(nèi)還是體外，二者的細(xì)胞形態(tài)、生長條件、增殖、基因表達(dá)以及分化為三個(gè)胚層細(xì)胞的能力方面都非常相似［5］。使用iPSCs代替ESCs不僅能克服一些倫理方面的問題，還能實(shí)現(xiàn)基因個(gè)體化。

1.2ESCs及iPSCs的定向分化能力

1.2.1ESCs向PGCs的定向分化研究人員發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)在體外培養(yǎng)的條件下能夠定向分化為雌性生殖細(xì)胞的前體，并能進(jìn)行減數(shù)分裂，形成濾泡樣結(jié)構(gòu)［6］。將mESCs與M15細(xì)胞(可分泌BMP4)混合進(jìn)行三維培養(yǎng)，隨后分離mESCs并與性腺基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，移植入雄性小鼠睪丸包膜下，移植的生殖細(xì)胞表現(xiàn)出植入到輸精小管樣管腔中的趨勢，并有一部分細(xì)胞產(chǎn)生了正常形態(tài)的精子［7］。人胚胎干細(xì)胞也能夠在體外培養(yǎng)的特定條件下向生殖細(xì)胞分化，并表達(dá)生殖細(xì)胞特異RNA和蛋白因子如VASA、SCP3［8］。去除飼養(yǎng)細(xì)胞以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等促進(jìn)細(xì)胞自我更新的因子之后，hESCs能夠自發(fā)分化為人原始生殖細(xì)胞(hPGCs)，不過頻率較低。在培養(yǎng)基中添加骨形成蛋白家族BMP-4、-7和-8b，延長培養(yǎng)時(shí)間，與人類或小鼠胚胎性腺基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，均能夠提高h(yuǎn)ESCs向PGCs分化的概率。此外，與人類胚胎性腺基質(zhì)細(xì)胞、小鼠睪丸支持細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或豬卵巢成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)也能夠提高h(yuǎn)ESCs/iPSCs定向分化為原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(PGCLCs)的概率［9］。

深入研究發(fā)現(xiàn)，hESCs/iPSCs經(jīng)由EpiLCs進(jìn)一步定向分化為PGCLCs。研究者在無血清、無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，在2個(gè)抑制因子MAPK inhibitor和GSK3 inhibitor及LIF的持續(xù)刺激下，將mESCs誘導(dǎo)成為EpiLCs［10］。EpiLCs向生殖細(xì)胞的進(jìn)一步分化需要激活素A(ActA)和bFGF的參與，并需要添加1%的血清替代品。研究發(fā)現(xiàn)，只有誘導(dǎo)2 d的Epi-LCs能夠大量分化為mPGC，而mESCs和誘導(dǎo)1、3 d 的EpiLCs不能夠分化為mPGC。Wnt3對于PGC的分化也是必要的，EpiLCs表達(dá)Wnt3的水平與外胚層細(xì)胞一致，證明其分化為PGC的能力［11］。在誘導(dǎo)生成PGCLCs的過程中，大部分誘導(dǎo)2 d的Epi-LCs具有分化為生殖細(xì)胞的潛能，但其中僅約40%的細(xì)胞獲得足量Blimp1(調(diào)節(jié)PGC生成的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)并分化為PGCLCs，可能有一些隨機(jī)的、物理的或內(nèi)在的差異導(dǎo)致約60%的EpiLCs沒有進(jìn)一步發(fā)育為生殖細(xì)胞［10］。

1.2.2iPSCs向PGCs的定向分化hiPSCs能夠定向分化為生殖細(xì)胞，而且?guī)缀跖chESCs分化為生殖細(xì)胞的潛能相同。BMP4能促進(jìn)來源于胚胎或成人的hiPSCs細(xì)胞向PGCLCs細(xì)胞分化，作用方式與ESCs類似［12］。隨后研究者成功誘導(dǎo)了其他組織來源的hiPSCs得到經(jīng)減數(shù)分裂后的單倍體細(xì)胞［13］。與ESCs相似，通過過表達(dá)DAZL和VASA來誘導(dǎo)由hiPSCs分化生成的PGCLCs進(jìn)行減數(shù)分裂［14］。然而與hESCs相比，iPSCs中的內(nèi)源性和外源性多能標(biāo)志因子的表達(dá)水平非常高，直至分化至14 d后二者才下降到同一水平［5］。已分化的hESCs和iPSCs的生殖細(xì)胞標(biāo)志因子的mRNA表達(dá)水平相當(dāng)。但是iPSCs分化為生殖細(xì)胞的數(shù)目較ESCs多［6］。

2　ESCs及iPSCs體外誘導(dǎo)生成的PGCs的發(fā)育

目前，體外分化生成的生殖細(xì)胞能否通過減數(shù)分裂產(chǎn)生具有功能的配子還是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。減數(shù)分離第一期包括聯(lián)會復(fù)合物(SC)形成、同源染色體配對、同源基因在交叉點(diǎn)重組等。采用針對SC特異蛋白進(jìn)行免疫熒光技術(shù)可鑒別減數(shù)分裂的不同階段，并通過FACS技術(shù)檢測單倍體配子是否形成。2004年，Geijsen等［15］利用擬胚體將mESCs分化成的SSEA/OCT4(生殖細(xì)胞標(biāo)志因子)陽性細(xì)胞分離，并在RA刺激下成功誘導(dǎo)了減數(shù)分裂，產(chǎn)生的單倍體細(xì)胞具有與成熟精子相同的表型及特異基因-Igf2r和H19。然后采用卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)證實(shí)了它們的功能。其他研究人員用不同的方法得到了同樣的結(jié)果［16，17］。但這些研究也暴露了體外生成配子存在的一些問題，尤其是在減數(shù)分裂和生殖細(xì)胞的成熟方面。

2006年，Novak等［18］將2個(gè)與雄性生殖細(xì)胞標(biāo)志物Stra8和Prmt1關(guān)聯(lián)的報(bào)告基因轉(zhuǎn)入mESCs中，建立了精原干細(xì)胞，培養(yǎng)基中加入RA后誘導(dǎo)精原干細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂并形成擬胚體，這些細(xì)胞能表達(dá)減數(shù)分裂期間和分裂后標(biāo)志物，證實(shí)體外生成了PGCLCs。然而把這些PGCLCs產(chǎn)生的精子植入被絕育小鼠的睪丸中，發(fā)現(xiàn)它們活力有限;通過ICSI將它們注入卵母細(xì)胞后產(chǎn)生了后代，證明它們是有功能的。但幾乎所有的幼崽都表現(xiàn)出表型的改變，如生長發(fā)育遲緩、過早死亡等。這可能是因?yàn)橛蒻ESCs分化而來的生殖細(xì)胞難以建立一個(gè)生殖細(xì)胞印記，從而導(dǎo)致異常甲基化［19］。

轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的過程中起重要作用。在性腺基質(zhì)缺乏的情況下，高度保守的RNA結(jié)合蛋白的基因修飾可引起生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂進(jìn)程;體外自發(fā)生成的生殖細(xì)胞經(jīng)過純化之后，在隨機(jī)加入的生長因子調(diào)控下也能夠完成減數(shù)分裂過程［20］。但以上研究中單倍體細(xì)胞的形成效率都非常低，有待進(jìn)一步提高。

2011年研究者首次報(bào)道了由雄性小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPSCs分化為EpiLCs，進(jìn)而生成PGCLCs并進(jìn)入減數(shù)分裂進(jìn)程的研究結(jié)果［10］。次年該研究小組報(bào)道了由雌性mESCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的PGCLCs發(fā)育為卵母細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生后代的研究成果［1］。由PGCLCs誘導(dǎo)產(chǎn)生后代的幾率低于PGCs和野生型卵母細(xì)胞。大部分由PGCLCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的卵母細(xì)胞的減數(shù)第一次分裂過程是正常的，而約一半的PGCLC衍生的卵母細(xì)胞未能分離出第二極體，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。最新的研究通過構(gòu)建易于操控的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)CD38糖蛋白是hPGCLC的表面標(biāo)記物。SOX17基因能夠調(diào)節(jié)BLIMP1，使其抑制形成hPGCLC過程中內(nèi)胚層和其他體細(xì)胞基因的表達(dá)，是hPGCLC形成的關(guān)鍵因子。而人類和小鼠PGCs分化的巨大不同很可能是由于二者截然不同的胚胎發(fā)育模式和不同的細(xì)胞多能性造成的。

3　展望

盡管研究者獲得具有個(gè)體特異性的iPSCs的組織和細(xì)胞類型日益廣泛，方法也日益改進(jìn)，但仍然沒有一種統(tǒng)一、高效、安全、方便的建立iPSCs細(xì)胞系的方法。不管是ESCs和iPSCs體外定向分化為PGCLCs，還是PGCLCs進(jìn)入減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體配子，這些過程的發(fā)生概率都非常低，且新生后代的健康狀況無法預(yù)測和控制。另外，由于小鼠和人類PGCLCs的誘導(dǎo)生成原理存在巨大差異，即使利用小鼠PGCLCs能夠生成功能配子并產(chǎn)生后代，但要將該技術(shù)應(yīng)用于人類，還需要更多更完善的研究。

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·經(jīng)驗(yàn)交流·

(收稿日期:2015-01-05)

通信作者:張?jiān)粕?/p>

文章編號:1002-266X(2015)18-0104-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R711

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.041