停乳鏈球菌活菌和死菌對日本沼蝦機體SOD活性和MDA含量影響的比較

趙衛(wèi)紅　張余霞　於葉兵　王資生　齊志濤

摘要：將健康日本沼蝦[（140 ± 012 g]隨機分為3組，注射2針PBS的對照組，第1針注射PBS、第2針注射停乳鏈球菌活菌的感染組，第1針注射停乳鏈球菌死菌、第2針注射停乳鏈球菌活菌的免疫組，2針相隔24 h。第2針注射后6 h、12 h、24 h、5 d和10 d分別采集肝胰腺、肌肉和鰓組織，測定其中的總超氧化物歧化酶（T-SOD活性和丙二醛（MDA含量。試驗結(jié)果顯示：感染組活菌注射6、12 h肌肉以及5 d肝胰腺中SOD活性相對于對照組均顯著升高（P<005；免疫組活菌注射6 h后肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性顯著高于感染組，而MDA含量顯著低于感染組（P<005；6、12、24 h肌肉、24 h肝胰腺、5 d鰓中SOD活性均為免疫組顯著高于感染組（P<005；12 h的肌肉和5 d的鰓中MDA含量，免疫組顯著小于感染組（P<005。結(jié)果表明，滅活鏈球菌注射日本沼蝦24 h后再注射活菌，6 h 后可提高日本沼蝦機體免疫活性，降低機體MDA含量。

關(guān)鍵詞：停乳鏈球菌；日本沼蝦；疫苗；總超氧化物歧化酶（T-SOD；丙二醛（MDA

中圖分類號： S9454+2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0284-03[HS][HT9SS]

[HJ14mm]

收稿日期：2014-11-15

基金項目：國家自然科學基金（編號：31101887）；江蘇省自然科學基金（編號：B2011419、B2012675）；江蘇省2011年企業(yè)博士聚集項目。

作者簡介：趙衛(wèi)紅（1973—），女，江蘇東臺人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)動物繁殖、營養(yǎng)與免疫方面的教學與研究工作。Tel：（0515）88298190；E-mail：misszwh@163com。

通信作者：王資生。E-mail：wzs@yciteducn。[HJ]

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense，別稱青蝦、河蝦，是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟品種，具有較高的食用價值和經(jīng)濟價值，并具有潛在的藥用價值[1]，由于其肉味鮮嫩、營養(yǎng)豐富，一直深受消費者喜愛。近年來，隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的快速發(fā)展，規(guī)模化高密度養(yǎng)殖模式的普及，水產(chǎn)動物間病原體交叉感染嚴重，細菌病等疾病的暴發(fā)制約著日本沼蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在我國一些水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)，均不同程度地暴發(fā)鏈球菌病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。大連某養(yǎng)殖場發(fā)生過對蝦鏈球菌病，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。近年來，廣東地區(qū)也出現(xiàn)南美白對蝦感染鏈球菌病例。雖然未見日本沼蝦養(yǎng)殖中鏈球菌病大規(guī)模暴發(fā)的報道，但是在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，停乳鏈球菌同樣對日本沼蝦具有較高的感染致死作用，因此，研究停乳鏈球菌對日本沼蝦免疫機能的影響對防范該菌所致疾病在蝦類養(yǎng)殖中大規(guī)模暴發(fā)，進一步探討甲殼動物的免疫機制有著現(xiàn)實的指導(dǎo)意義。超氧化物歧化酶（SOD是細胞內(nèi)最有效的抗氧化酶之一，SOD促進生物體內(nèi) O-2[G-2]· [G-3]與H+反應(yīng)生成H2O2，從而降低 O-2[G-2]· [G-3]對生物體的傷害，是生物體內(nèi)清除活性氧從而保護機體組織的第1道防線。SOD 活性與甲殼動物的免疫能力有重要關(guān)系[4-5]。生物膜中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA受到 O-2[G-2]· [G-3]攻擊，會產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用，產(chǎn)生丙二醛（malondiadehyde，MDA等脂質(zhì)過氧化物，引起細胞損傷，最終降低甲殼動物的免疫水平，因此MDA含量常常可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映機體抗氧化能力[6]。筆者所在課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)給日本沼蝦注射一定劑量的停乳鏈球菌死菌后再進行活菌感染，死亡率顯著低于單獨注射活菌（未發(fā)表。為了研究預(yù)先注射死菌降低其活菌感染死亡率的機理，本研究主要比較停乳鏈球菌死菌注射后感染活菌和活菌單獨感染的日本沼蝦肝胰腺、肌肉和鰓中T-SOD活性和MDA含量的變化，為日本沼蝦停乳鏈球菌疫苗研制提供理論支撐。

1材料與方法

11試驗蝦及其養(yǎng)殖管理

從鹽城人民菜場購買日本沼蝦（11±02 g400尾，實驗室暫養(yǎng)7 d后選取規(guī)格整齊、活潑健壯個體進行停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae，以下簡稱鏈球菌注射試驗，試驗期間投喂體重3%的鮮活碎河蚌肉，每天投喂2次。每天24 h充氧，試驗期間水溫為20 ℃，試驗蝦養(yǎng)殖于規(guī)格為100 L水族箱中，每箱60尾。

12鏈球菌的獲得和配制

鏈球菌來源于得病的鱘魚（sturgeon，從10條患病的鱘魚體內(nèi)分離獲得，通過生理、生化特性和分子分析確認。

鏈球菌在24 ℃下于100 mL Todd Hewitt培養(yǎng)基（THB中振蕩培養(yǎng)24 h。10 000 r/min離心10 min后收集，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，01 mol/L，pH值=70沖洗3遍后用PBS制成6×106 CFU懸液備用。40%的福爾馬林滅活活菌24 h獲得死菌。注射用菌液現(xiàn)配現(xiàn)用。

13菌種注射方案

試驗分3組，每組3個平行，每個平行60尾蝦，均注射2針，2針注射間隔時間為24 h。第1組為對照組，注射2針PBS；第2組為感染組，第1針注射PBS，第2針注射 6×106 CFU 活菌；第3組為免疫組，第1針注射6×106 CFU死菌，第2針注射6×106 CFU活菌。第2腹甲和第3腹甲之間與身體呈45°角處進行肌肉注射，注射劑量10 μL/尾。

14日本沼蝦組織的提取與處理

取樣前24 h停食，第2針注射6 h、12 h、24 h、5 d和10 d后取5尾試驗蝦的肝胰腺、肌肉、鰓的組織，用于SOD活性和MDA含量的測定。測定時肌肉和鰓按重量體積比加生理鹽水制成10%的組織勻漿，肝胰腺制成5%的組織勻漿，6 000 r/min 離心15 min，上清液用于SOD活性和MDA含量的測定。endprint

15蛋白濃度的測定

采用南京建成生物工程研究所考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒。原理：蛋白質(zhì)分子有-NH+3基團，當棕紅色的考馬斯亮藍顯色劑加入蛋白標準液或樣品中時，考馬斯亮藍染料上的陰離子與蛋白-NH+3結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{色，通過測定吸光度可計算出蛋白含量。

16SOD活性的測定

總SOD酶活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定，方法為黃嘌呤氧化法。SOD活性定義為1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活性單位（U。

17MDA含量測定

MDA含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。其原理為過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸（thibabituric acid，TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，簡稱TBA法。

18數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差形式表示，經(jīng)Excel2007初步整理后，用SPSS180對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA，用Duncan氏法進行多重比較，分析組間差異顯著性程度，顯著水平為P<005。

2結(jié)果與分析

21肌肉注射鏈球菌對日本沼蝦各組織SOD活性的影響

日本沼蝦肌肉注射鏈球菌活菌后各組織SOD活性變化如下：12 h和24 h肝胰腺中SOD活性和對照組的差異不大，5 d 后顯著升高（P<005，為對照組的9倍左右；肌肉中SOD活性在注射6 h達到最大值，為對照組的7倍左右；鰓中SOD活性注射后6 h、12 h、24 h和5 d變化不大（表1；10 d后所有注射活菌組肝胰腺中SOD活性均降為對照組的一半左右（表1。

感染組和免疫組SOD活性差異如下：6 h免疫組肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性均顯著高于感染組（P<005；所有時間段免疫組肌肉中SOD活性均高于感染組，其中6 h、12 h和24 h后2組差異顯著（P<005，5 d和10 d差異不顯著（P>005；24 h肝胰腺和5 d鰓中SOD活性免疫組顯著高于感染組（P<005（表1。[FL]

[F（W11][HT6H][J][WTH]表1鏈球菌對日本沼蝦組織中SOD活性的影響[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5。2，W50W]組織組別SOD活性相對于對照組的比值

[BHDWG12，W10。5W]6 h12 h24 h5 d10 d[BW]

[BHDG12，W5。2，W10。5DWW]肝胰腺感染組105±005bA146±002bA114±011bA899±020cD046±001aA

[BHDW]免疫組275±035cB144±046bA179±001bB912±010dD057±001aA

肌肉感染組743±035eD500±002dB121±005bA324±004cC043±002aA

免疫組1862±258dE698±027cC460±011bC410±039bC072±002aA

鰓感染組136±004bA128±001bA104±003bA139±002bA054±001aA

免疫組537±045dC122±012bA125±003bA235±003cB052±003aA[HJ][BGF]

注：表中數(shù)字后面的字母不同表示差異顯著（P<005，相同表示差異不顯著（P>005，其中小寫字母表示同行數(shù)據(jù)之間比較，大寫字母表示同列數(shù)據(jù)之間比較。[F]

[FL（22]22肌肉注射鏈球菌疫苗對日本沼蝦各組織MDA含量的影響

肌肉注射鏈球菌活菌對各組織中MDA含量的影響如下：6 h肝胰腺中MDA含量急劇增加，高達對照組的24倍左右，而12 h后肌肉中MDA含量顯著增加至對照組的464倍左右（P<005；24 h后肝胰腺和鰓中MDA含量均低于對照組，鰓中只有對照組的28%左右。

相同感染時間同組織內(nèi)感染組和免疫組MDA含量之間的比較結(jié)果為：注射6 h后感染組肝胰腺、肌肉和鰓中MDA含量均顯著大于免疫組（P<005；注射12 h后肝胰腺和鰓中則相反，感染組顯著小于免疫組（P<005；注射5 d免疫組鰓中MDA含量顯著高于免疫組（P<005（表2。[FL]

[F（W10][HT6H][J][WTH]表2鏈球菌對日本沼蝦組織中MDA含量的影響[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5。2，W50W]組織組別MDA含量相對于對照組的比值

[BHDWG12，W10。5W]6 h12 h24 h5 d10 d[BW]

[BHDG36mm，W5。2，W10。5DWW]肝胰腺感染組2461±101dE102±008bcA053±002aA087±001abA118±002cA

[BHDW]免疫組114±024bD295±012cC053±001aA131±001bC121±001bA

肌肉感染組023±003aB464±047cD127±006bB119±004bBC128±025bAB

免疫組007±001aA223±012cBC167±013bcB129±004bC142±008bA

鰓感染組065±002bC103±007bA028±001aA103±001bB228±001cC

免疫組019±002aB204±009bB041±001aA050±002aA189±009bBC[HJ][BGF]

注：表中數(shù)字后面的字母不同表示差異顯著（P<005，相同表示差異不顯著（P>005，其中小寫字母表示同行數(shù)據(jù)之間比較，大寫字母表示同列數(shù)據(jù)之間比較。[F]endprint

[FL（22]3討論

31鏈球菌活菌對日本沼蝦SOD活性和MDA含量

O-2[G-2]· [G-3]能夠與生物膜不飽和脂肪酸進行反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，形成細胞損傷，造成功能性障礙，甚至會使組織變性壞死，破換機體代謝平衡。SOD是機體內(nèi)一種能夠直接清除 O-2[G-2]· [G-3]的抗氧化酶。機體清除 O-2[G-2]· [G-3]的能力可以由SOD活性的高低間接反映，機體受到細菌感染時，體內(nèi)SOD活性會發(fā)生改變。本試驗結(jié)果表明，感染組注射鏈球菌活菌感染10 d后機體肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性均低于對照組，這和羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii感染莫格球擬酵母后[7]和斑節(jié)對蝦Penaeus monndon感染典型弧菌后[8]的研究結(jié)果類似。日本沼蝦注射鏈球菌活菌6 h肌肉中SOD活性達到對照組的7倍左右，6～24 h肌肉中SOD活性隨著作用時間的延長逐漸降低。這一結(jié)果與鎘對克氏原螯蝦Procambarus clarkii脅迫中的報道結(jié)果類似，鎘脅迫24 h克氏原螯蝦體內(nèi)SOD活性達到最大值，隨著作用時間的推移，SOD活性逐漸降低[9]。機體遇到不良環(huán)境脅迫會做出應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)動機體免疫因子，如促使SOD活性急劇增加以清除體內(nèi)脅迫產(chǎn)生的 O-2[G-2]· [G-3]?；罹腥?、12 h日本沼蝦肌肉中SOD活性均顯著高于肝胰腺和鰓，這和本試驗中肌肉注射的感染方式有關(guān)。感染至5 d肝胰腺中SOD活性顯著升高，肝胰腺是甲殼動物最重要的免疫器官，面對細菌的侵染，肝胰腺中SOD活性升高，擔負起清除體內(nèi) O-2[G-2]· [G-3]的作用。

MDA作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，在組織中的含量可以表現(xiàn)生物體細胞過氧化的水平。注射鏈球菌活菌6 h后肝胰腺中MDA含量急劇增加，而6 h后肌肉中MDA反而低于對照組，在12 h后肌肉中MDA含量才急劇增加。機體MDA含量與多種因素有關(guān)，機體在不良環(huán)境刺激下會產(chǎn)生 O-2[G-2]· [G-3]， O-2[G-2]· [G-3]含量與機體MDA含量有關(guān)，同時 O-2[G-2]· [G-3]與SOD活性有關(guān)，日本沼蝦注射活菌后6 h肌肉中SOD活性急劇增加，可能是此時MDA含量降低的原因。MDA短時間內(nèi)在肝胰腺中大量增加，可能有以下幾個方面的原因：首先肝胰腺是日本沼蝦最重要的免疫器官，是 O-2[G-2]· [G-3]首先攻擊的部位；另外肝胰腺含有大量的不飽和脂肪酸，這些不飽和脂肪酸在 O-2[G-2]· [G-3]的氧化下會產(chǎn)生大量的MDA，而此時檢測到機體肝胰腺中的SOD活性相對于對照組變化不大，沒有起到應(yīng)對短時間內(nèi)產(chǎn)生的 O-2[G-2]· [G-3]氧化的作用，上述幾個方面綜合作用，促使肝胰腺中MDA含量大量增加。

有研究表明，MDA含量與外界刺激物具有劑量-時間效應(yīng)。如沼水蛙蝌蚪MDA 含量隨著有機磷農(nóng)藥作用時間與濃度的增加而增加[10]，劍尾魚（Xiphophorushelleri heckel肝臟中MDA含量在整個汞染毒過程中隨著染毒時間的延長而持續(xù)升高[11]。本試驗中日本沼蝦肝胰腺中MDA 的含量在鏈球菌活菌感染6 h達到最高，在肌肉中MDA含量在12 h達到最高，隨后降低，這一結(jié)果與王奇等[12]和羅義等[13]的研究結(jié)果相似，MDA在24 h達到最高，隨著暴露時間的延長，MDA 含量逐漸下降。這表明6×106 CFU的鏈球菌活菌注射日本沼蝦發(fā)生的氧化損傷是可逆的。

32滅活鏈球菌疫苗對日本沼蝦SOD活性及MDA含量的影響

筆者所在課題組在前期研究過程中發(fā)現(xiàn)福爾馬林滅活鏈球菌注射后會大大降低其活菌感染后的死亡率（未發(fā)表。滅活疫苗是采用物理或者化學方法殺死具有感染性的完整病原生物，使該病原生物失去傳染其他生物體能力的同時保留其抗原性，并能夠用于預(yù)防免疫的生物制品制備。水產(chǎn)上研究較多的有弧菌滅活苗、嗜水氣單胞菌疫苗、鏈球菌疫苗等[14]。我國有關(guān)滅活疫苗在水產(chǎn)上的研究主要集中在魚類，且目前大部分還停留在疫苗對死亡率的影響方面，有關(guān)其機理研究較少[14]。本試驗中，用福爾馬林滅活的停乳鏈球菌作為抗鏈球菌的疫苗，注射24 h后感染鏈球菌活菌，比較其與單獨感染活菌不同時間段組織中SOD活性和MDA含量的變化，初步探討滅活鏈球菌對日本沼蝦免疫機能的影響。本試驗中免疫組注射活菌6 h后肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性均顯著高于對照組，MDA含量顯著低于對照組。這表明疫苗在注射30 h后對日本沼蝦產(chǎn)生了免疫保護作用，當機體再次受到鏈球菌侵襲時，機體迅速做出反應(yīng)，產(chǎn)生大量SOD，消滅體內(nèi)多余 O-2[G-2]· [G-3]，降低MDA含量。滅活菌作為疫苗注射可以提高水產(chǎn)動物免疫機能的報道在虹鱒（Oncorhynchus mykiss中也有報道，Ispir等[15]制備了福爾馬林滅活耶爾森氏菌疫苗，發(fā)現(xiàn)這種疫苗能夠提高虹鱒的吞噬細胞活性。此外陳昌福[16]通過對鯉魚母源的免疫研究，證明了雌親魚不僅可以產(chǎn)生很強的免疫反應(yīng)，而且其凝集抗體可以傳遞給子代并對初生幼體產(chǎn)生作用。

綜上所述，停乳鏈球菌活菌注射6 h肌肉中SOD活性大量增加，5 d肝胰腺中SOD活性大量增加，6 h肝胰腺中MDA含量大量增加。滅活鏈球菌注射后24 h再注射鏈球菌活菌，6 h后肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性顯著高于單獨注射鏈球菌活菌，MDA含量顯著低于單獨注射鏈球菌活菌。

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