除臭效果菌株中具有分解纖維素能力菌株的篩選及鑒定

廖瀚峰 周禮紅 潘肇儀 高燕燕 韋名科

摘要：為了篩選同時(shí)具有除臭和產(chǎn)纖維素酶能力的菌株，采用濾紙崩解試驗(yàn)初篩篩選到6株具有產(chǎn)纖維素酶能力的菌株，通過(guò)用DNS法測(cè)定其濾紙酶、內(nèi)切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活進(jìn)行復(fù)篩，最終篩選到具有較高產(chǎn)纖維素酶能力的菌株G2，其酶活力分別為1737、3179、1232 IU/mL。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA分子鑒定，初步確定該菌株為淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens，從而為微生物除臭菌劑的制備提供了菌種資源。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；濾紙崩解試驗(yàn)；篩選鑒定；16SrDNA

中圖分類(lèi)號(hào)： X173文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（201412-0386-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-01-13

作者簡(jiǎn)介：廖瀚峰（1989—，男，廣西桂林人，碩士研究生，從事微生物菌劑研究。E-mail：5851122lhf@163com。

通信作者：周禮紅，博士，副教授，從事微生物研究。E-mail：Lhzhou33@126com。

垃圾處理是當(dāng)代世界各國(guó)共同關(guān)注并亟待解決的環(huán)境問(wèn)題之一，也是城市發(fā)展與健康領(lǐng)域中的一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容。我國(guó)城市生活垃圾年清運(yùn)量約為16億t，除少部分焚燒、堆肥或回收利用外，絕大部分被運(yùn)送到填埋場(chǎng)進(jìn)行填埋處置，在填埋過(guò)程中由于有機(jī)質(zhì)腐敗分解，不可避免地造成惡臭污染[1-2]。城市突發(fā)性惡臭污染越來(lái)越嚴(yán)重，嚴(yán)重干擾了人們的正常生產(chǎn)生活，投訴量不斷攀升[3-4]。近些年來(lái)，在北京、上海、杭州、廣州等一些大中城市發(fā)生的垃圾填埋場(chǎng)惡臭擾民事件，成為填埋場(chǎng)周邊地區(qū)的社會(huì)不穩(wěn)定因素，嚴(yán)重制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境的持續(xù)發(fā)展。

我國(guó)城市垃圾比較特殊，垃圾中有機(jī)物占主要成分，主要有淀粉、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等。其中木質(zhì)素難以被微生物降解[5]；纖維素和半纖維素因?yàn)榫哂芯o密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使其具有很強(qiáng)的不可降解性，積累過(guò)多會(huì)導(dǎo)致環(huán)境問(wèn)題。城市生活垃圾中有大量纖維素，且隨著人們生活水平提高而呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[6]。所以纖維素和半纖維素的處理也是生物法處理城市垃圾的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[7]。篩選出同時(shí)具備分解纖維素和快速除臭能力的菌株對(duì)于采用生物法處理城市垃圾尤為重要。本研究通過(guò)篩選出具有產(chǎn)纖維素酶能力的快速除臭菌株，以期為提高生物法處理城市垃圾效率、微生態(tài)除臭提供更多的微生物菌種資源。

1材料與方法

11材料

111供試菌株供試菌株為貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存的16株具有快速發(fā)酵及一定除臭功能的菌株（分別編號(hào)為G1、G2、G3、G4、G5、X1、X2、X3、X4、X5、X6、F1、F2、F3、Y1、Y2。

112試劑DNS試劑[8]、005 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH值85、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制的1 % 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na溶液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制的1%水楊苷溶液、蒸餾水。

113培養(yǎng)基（1濾紙崩解培養(yǎng)基：05 g MgSO4，2 g H2PO4，05 g Cl，0001 g FeSO4·7H2O，10 g酵母膏，1 g蛋白胨，1 000 mL蒸餾水，自然pH值。（2發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：10 g CMC-Na，05 g MgSO4，2 g 2HPO4，05 g Cl，001 g FeSO4·7H2O，5 g[JP2]酵母膏，05 g蛋白胨，1 000 mL蒸餾水，pH值為72～74。（3菌種活化培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，16 g瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水，pH值為72。

114主要設(shè)備與儀器S1000 PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)伯樂(lè) BIO-RAD 公司生產(chǎn)；DYY-11型電泳儀，北京市六一儀器廠生產(chǎn)；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司生產(chǎn)；TH2-82A數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器，常州普天儀器有限公司；Olympus生物顯微鏡，奧林巴斯株式會(huì)社。

12方法

121種子液的制作將供試菌株轉(zhuǎn)接到用250 mL三角瓶裝的100 mL液體菌種活化培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h，制成種子液。

122濾紙崩解試驗(yàn)將活化后的供試菌株接種到用 250 mL 三角瓶裝的150 mL濾紙崩解培養(yǎng)基中，再加入1條15 cm×80 cm滅菌過(guò)后的Whatman No1濾紙條，同時(shí)設(shè)立不接任何菌株的空白對(duì)照C，在37 ℃、160 r/min下培養(yǎng)；間隔 72 h 后，觀察濾紙片的崩解情況，并選出濾紙崩解效果明顯的菌株，測(cè)定其濾紙酶、內(nèi)切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶的酶活。

123粗酶液的提取將濾紙崩解效果明顯的菌株從試管斜面轉(zhuǎn)接至發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng) 48 h，再于4 000 r/min離心10 min，取上清液，即為粗酶液。

124濾紙酶活的測(cè)定[9] 在試管中放入1 cm×6 cm的Whatman NO1濾紙（約50 mg1條，加入05 mL適當(dāng)稀釋的纖維素酶粗酶液以及1 mL 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，45 ℃ 溫浴60 min后，立即加入3 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴 5 min 后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，在540 nm扣除空白測(cè)吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成IU/mL?？瞻坠艿拇置敢合扔梅兴?0 min，加入DNS試劑后加入粗酶液，其余操作和樣品管一樣。1個(gè)濾紙酶活力單位定義為：以濾紙為底物，在45 ℃恒溫的條件下，水解反應(yīng)中1 min催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量。

125內(nèi)切葡聚糖苷酶的測(cè)定在試管中加入05 mL適當(dāng)稀釋的纖維素酶粗酶液和2 mL 1% CMC-Na溶液作為底物，45 ℃溫浴30 min后，立即加入3 mL的DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5 min后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，冷卻后在540 nm扣除空白測(cè)吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成IU/mL?？瞻坠艿拇置敢合扔梅兴?0 min，加入DNS試劑后加入粗酶液，其余操作和樣品管一樣。1個(gè)內(nèi)切葡聚糖苷酶活力單位定義為：以1%CMC-Na為底物，在 45 ℃ 恒溫的條件下，水解反應(yīng)中1 min催化底物水解形成 1 μmol 葡萄糖的酶量。

126β-葡萄糖苷酶的測(cè)定在試管中加入05 mL適當(dāng)稀釋的纖維素酶粗酶液和2 mL 1%水楊苷溶液作為底物，45 ℃ 溫浴60 min后，立即加入3 mL的DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5 min后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，冷卻后在540 nm扣除空白測(cè)吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成IU/mL?？瞻坠艿拇置敢合扔梅兴?0 min，加入DNS試劑后加入粗酶液，其余操作和樣品管一樣。1個(gè)β-葡萄糖苷酶酶活力單位定義為：以1%水楊苷為底物，在 45 ℃ 恒溫的條件下，水解反應(yīng)中1 min催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量。

12716S rDNA 序列分析采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式基因組 DNA 抽提試劑盒（細(xì)菌提取。

PCR 反應(yīng)體系（ 25 μL：125 μL Dream TaqTM Green PCR Master Mix（2×；1 μL 16S上游通用引物27F；1 μL 16S下游通用引物1492R；95 μL ddH2O；1μL模板DNA。

上游通用引物27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游通用引物1492R序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，4 min；94 ℃預(yù)變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 15 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃停止。

PCR 產(chǎn)物由生工生物工程上海股份有限公司使用Applied Biosystems 3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。將所得序列通過(guò) NCBI的BLAST功能進(jìn)行序列比對(duì)分析。利用MEGA 50軟件制作系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果與分析

21初篩試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)濾紙崩解試驗(yàn)，從供試菌中篩選具有產(chǎn)纖維素酶能力的菌株。將16株供試菌接入有無(wú)菌濾紙條的濾紙崩解培養(yǎng)基后72 h觀察結(jié)果?？瞻捉M濾紙條保持完整，邊緣沒(méi)有崩解情況。菌株F1對(duì)濾紙條產(chǎn)生一定程度的崩解效果，濾紙發(fā)生斷截并且邊緣呈絮狀，但總體保持完整。菌株Y6、X1、X4、G1均對(duì)濾紙產(chǎn)生明顯的崩解效果，培養(yǎng)基渾濁且底部有部分絮狀物，推測(cè)是濾紙條完全崩解后產(chǎn)生的沉淀物。菌株G2對(duì)濾紙條表現(xiàn)出較為徹底的崩解效果，培養(yǎng)基相對(duì)于其他菌株較為澄清，底部只有少量絮狀殘留物。Y1等其余10株供試菌株沒(méi)有明顯的濾紙崩解現(xiàn)象（圖1。[FL]

[F（W11][TPLHF1tif][F]

[FL（22]22復(fù)篩試驗(yàn)

將濾紙崩解作用明顯的6個(gè)菌株用液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵2 d后測(cè)定其濾紙酶、內(nèi)切葡聚醣苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活。根據(jù)濾紙崩解和酶活力測(cè)定結(jié)果篩選出具有較高纖維素酶活力的菌株。在45 ℃、pH值85條件下，G2的濾紙酶活性和內(nèi)切葡聚糖苷酶活性最高，分別為1737、3179 IU/mL，比其他菌株至少分別高出5001%、2902%。濾紙酶活性最低的是F1菌株，為0616 IU/mL，同時(shí)其β-葡萄糖苷酶活性只有0394 IU/mL，這可能是在濾紙崩解試驗(yàn)中該菌株對(duì)濾紙條的分解利用不如其他5個(gè)菌株的原因（圖2。關(guān)于纖維素酶水解天然纖維素的機(jī)制，目前普遍認(rèn)為是由纖維素酶3種組分協(xié)同作用的結(jié)果。內(nèi)切葡聚糖苷酶負(fù)責(zé)進(jìn)攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶還原性末端或非還原性末端的小分子纖維素，外切葡聚糖苷酶從纖維素線狀分子的末端水解切下纖維二糖單位，β-葡萄糖苷酶最后將纖維二糖水解成葡萄糖[10]。雖然菌株G1內(nèi)切葡聚糖苷酶活性較低（0628 IU/mL，生成小分子纖維素效率較慢，但是高活性的β-葡萄糖苷酶（1441 IU/mL可以快速將由外切葡聚糖苷酶水解產(chǎn)生的纖維二糖水解成葡萄糖，故G1的濾紙酶活性依然可以保持在較高的水平。

結(jié)合濾紙崩解試驗(yàn)和酶活力測(cè)定試驗(yàn)，認(rèn)為G2是有相對(duì)較高纖維素酶活力的菌株，其濾紙酶、內(nèi)切葡聚醣苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活分別為1737、3179、1232 IU/mL。

23高纖維素酶活力菌株G2的鑒定

菌株G2的顯微形態(tài)：菌體呈短桿狀，大小為（05～08 μm×（15～30 μm，染色均勻，具運(yùn)動(dòng)性，兼性厭氧，可形成內(nèi)生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形， 芽孢著生點(diǎn)在菌體

[F（W10][TPLHF2tif][F]

中心，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染色陽(yáng)性（圖3。菌株G2在LB培養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則，在多種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)色素。

以菌株G2的全基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到1條約15 kb的特異性條帶，經(jīng)序[CM（25]列測(cè)定，長(zhǎng)度為1 452 bp。將其與GenBank中報(bào)道菌株的[CM]

[F（W10][TPLHF3tif][F]

16S rDNA序列進(jìn)行相似性分析表明，親緣關(guān)系相近的前20個(gè)序列都為芽孢桿菌屬（Bacillus的菌株，同源性均超過(guò)98%。運(yùn)用MEGA50軟件中的鄰接法計(jì)算菌株G2的16S rDNA序列與同源性99%以上序列的進(jìn)化關(guān)系，以地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis作外群，經(jīng)1 000次bootstrap驗(yàn)證，獲得系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4。[FL]

[F（W11][TPLHF4tif][F]

[FL（22]結(jié)合形態(tài)學(xué)與16S rDNA分子鑒定結(jié)果，初步確定G2為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens。

3結(jié)論

國(guó)際上常用的除臭方法一般有化學(xué)法、物理法和生物法。生物除臭法中主要的作用因素是具有除臭功能的微生物，篩選高效除臭菌不僅可以提高惡臭物質(zhì)的消化和降解速率，抑制惡臭菌的生長(zhǎng)，同時(shí)也能夠有效分解垃圾中難降解的大分子有機(jī)物。國(guó)內(nèi)對(duì)垃圾微生物除臭已有相關(guān)研究，如王光玉等利用微生物加速降解條件的初步研究[10]；汪英學(xué)等篩選可以降低垃圾填埋場(chǎng)氨氣和硫化氫氣體的微生物[11]；葉勁松等研究了垃圾中纖維素含量與纖維素降解菌之間的變化規(guī)律[12]。但是目前尚未篩選出同時(shí)具有除臭和產(chǎn)纖維素酶能力菌株的相關(guān)報(bào)道。本研究從貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供的具有快速發(fā)酵和除臭功能的菌株中，通過(guò)濾紙崩解試驗(yàn)篩選到6株具有一定產(chǎn)纖維素酶能力的菌株。通過(guò)在45 ℃、pH值85條件下測(cè)得各菌株的濾紙酶、內(nèi)切葡聚醣苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活，挑選出纖維素酶活性最好的菌株G2。通過(guò)形態(tài)學(xué)和菌株16S rDNA擴(kuò)增與分析，初步確定G2是解淀粉芽孢桿菌（B amyloliquefaciens。[JP+1]本試驗(yàn)篩選出同時(shí)具有除臭及產(chǎn)纖維素酶能力的菌株，對(duì)有效利用分解城市垃圾中的纖維素和半纖維素、縮短垃圾發(fā)酵時(shí)間、增加垃圾發(fā)酵效率，以及為微生物除臭菌劑的制備提供菌種資源。

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