液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)田七花總皂苷中三七皂苷R1的含量

陳玉勇　秦楓　朱善元　黃文強(qiáng)　卞歡

摘要：建立了檢測(cè)田七花總皂苷中三七皂苷R1含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS方法。用BDS HYPERSUL C18（150 mm×21 mm，5 μm色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速03 mL/min，柱溫30 ℃；質(zhì)譜分析采用三重四桿質(zhì)譜儀，多反應(yīng)檢測(cè)（MRM模式，[JP2]電噴霧離子源（ESI負(fù)離子檢測(cè)，定量分析的離子為：三七皂苷R1 m/z 9317→7996，內(nèi)標(biāo)物紫杉醇m/z 8525→5253。三七皂苷R1標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為00476～119 μg/mL，平均加樣回收率為9933%，RSD為165%（n=6。精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性均符合樣品分析的要求。

關(guān)鍵詞：田七花；三七皂苷R1；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)： Q94683+84；O65763文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（201412-0319-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-07-07

基金項(xiàng)目：江蘇省高校“青藍(lán)工程”科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目；江蘇省泰州市科技支撐（農(nóng)業(yè)計(jì)劃（編號(hào)：TL0719。

作者簡(jiǎn)介：陳玉勇（1978—，男，江蘇泰州人，博士研究生，講師，主要從事食品生物技術(shù)、食品分析等研究。E-mail：chenyuyong@tomcom。

通信作者：秦楓，碩士，副教授，從事天然藥物及食品新資源開發(fā)等方向研究。E-mail：qinancy922@tomcom。

田七花為五加科植物田七[Panax notoginseng （Burk FH]的干燥花蕾，田七花作為云南文山州的傳統(tǒng)生物資源，廣泛應(yīng)用于食品、保健品以及中藥藥材。例如，當(dāng)?shù)爻Ｓ锰锲呋ㄅ莶鑋1]，制作點(diǎn)心，或與其他食材一起制成滋補(bǔ)品，長(zhǎng)期食用對(duì)于治療高血壓、咽痛音啞和養(yǎng)生都頗有裨益[3-4]。田七花中含有皂苷、多糖、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，其中，皂苷是其主要生理活性成分，楊明晶等發(fā)現(xiàn)田七花苷沒有毒性作用[7]，故近年來(lái)，將田七花進(jìn)一步開發(fā)為保健品的研究較為熱門。Yang 等已經(jīng)從田七花中鑒定出170種單體皂苷，發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1是皂苷中的一種主要成分[8]。目前，關(guān)于田七花中三七皂苷R1含量檢測(cè)的方法有比色法[9]和HPLC法[10-11]等，但是比色法只能檢測(cè)其中總皂苷的含量，HPLC法運(yùn)行時(shí)間一般在15 min以上，且靈敏度低、專屬性差。因此，筆者參照文獻(xiàn)[12]對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了 HPLC-MS/MS 分析方法，該法能夠靈敏地檢測(cè)田七花蕾中三七皂苷R1的含量，可為三七花總皂苷（SFPN和以其為主要成分的保健食品的含量檢測(cè)提供一定參考。

1材料與方法

11儀器

三重四桿質(zhì)譜儀（API 4000型，配有電噴霧離子源（ESI，采用美國(guó)ABI公司的Analyst 141 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)；高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 1100；Q2200B型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（浙江省金華市文華科教實(shí)驗(yàn)儀器廠；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠；SH-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠；Direct-Q3型超純水機(jī)（江蘇省蘇州塞恩斯儀器有限公司。

12對(duì)照品與試劑

三七皂苷R1（批號(hào)：110745-201318，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。紫杉醇（批號(hào)：100382-201201，購(gòu)自云南省昆明科翔生物科技有限公司。田七干燥花蕾，由云南省文山壯族苗族自治州文山三七研究院提供。

D101大孔樹脂購(gòu)自江蘇省泰州醫(yī)藥公司。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余均為分析純?cè)噭?/p>

13HPLC-MS/MS分析條件

131高效液相色譜條件

色譜柱為 BDS HYPERSUL C18（150 mm×21 mm，5 μm；流動(dòng)相為水（A和乙腈（B，流速為[CM（25][G5]03[G2]mL/min，柱溫為[G5]30[G2]℃，進(jìn)樣量為[G5]10[G2]μL。梯度洗脫方[CM]

[HS2]式為流動(dòng)相B：20%[FY（]2 min[FY]30%[FY（]5 min[FY]75%[FY（]10 min[FY]90%。

132質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI負(fù)離子檢測(cè)，多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM。設(shè)制離子噴霧電壓（IS為4 100 V；離子源霧化溫度（TEM為450 ℃；去集簇電壓（DP為-105 V；激發(fā)碰撞電壓（CE為-47 V。采用的定量分析離子為：三七皂苷R1 m/z 9317→7996；內(nèi)標(biāo)物紫杉醇m/z 8525→5253。

14樣品處理

141對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

稱取三七皂苷R1 119 mg，[JP+1]以甲醇定容至10 mL，得到對(duì)照品儲(chǔ)備液。稱取紫杉醇101 mg，以甲醇超聲溶解，定容至10 mL，再取該溶液100 μL以甲醇定容至10 mL，渦旋振蕩溶解，即得內(nèi)標(biāo)溶液。

142供試品溶液的制備

參照Sun等的方法[13]，制備田七花總皂苷（SFPN。將田七干燥花蕾1 kg粉碎，過20目篩，以10倍質(zhì)量70%乙醇回流提取3次，每次提取15 h。合并提取液，減壓濃縮，并以適量水混懸，再分別以乙醚、正丁醇萃取，棄去醚層，收集正丁醇層，減壓濃縮，抽干溶劑。將正丁醇萃取物經(jīng)D101大孔樹脂先以水洗脫，棄去洗脫液，再以90%乙醇洗脫，收集洗脫液，于45 ℃左右減壓濃縮至干燥固態(tài)，即為田七花總皂苷（SFPN。共制備了5個(gè)批次的SFPN（批號(hào)分別為20130502、20130816、20130902、20131011、20131112。

稱取對(duì)應(yīng)批號(hào)的SFPN粉末02 g，加甲醇定容至10 mL，超聲輔助溶解，得供試品儲(chǔ)備液。取內(nèi)標(biāo)溶液100 μL和供試品儲(chǔ)備液100 μL，加甲醇定容至1 mL，渦旋振蕩溶解，經(jīng) 045 μm 微孔濾膜過濾，得供試品溶液。endprint

2結(jié)果與分析

21方法的專屬性和特異性

按“13”節(jié)中液相色譜和質(zhì)譜條件對(duì)SFPN中三七皂苷R1進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。圖 1為對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物總離子流圖，圖2為SFPN和內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖。在選定色譜條件下，被分析的化合物三七皂苷R1和內(nèi)標(biāo)物紫杉醇分別在約618 min和935 min時(shí)出峰，對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物的峰形和分離度較好，靈敏度強(qiáng)；同時(shí)采用保留時(shí)間和離子對(duì)的響應(yīng)強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行分析，更有效避免了其他物質(zhì)對(duì)這種皂苷測(cè)定的干擾，具有較好的專屬性和特異性。[FL]

[F（W14][TPCYY1tif][F]

[F（W14][TPCYY2tif][F]

[FL（22]

22標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍考察

以對(duì)照品儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)溶液來(lái)配制不同濃度對(duì)照品溶液，將三七皂苷R1的濃度分別調(diào)至0047、0119、0476、119、476、119 μg/mL，進(jìn)樣量為10 μL。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，制作回歸曲線，用加權(quán)（W=1/C2最小二乘法進(jìn)行回歸分析[14]，求得直線回歸方程為y=33x+0027 8，相關(guān)系數(shù)（r為0999 8，線性范圍為0047 6～119 μg/mL。

23精密度試驗(yàn)

對(duì)照品溶液連續(xù)六針進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行精密度試驗(yàn)。計(jì)算對(duì)照品的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，并統(tǒng)計(jì)出比值的RSD為185%，表明儀器精密度較好。

24穩(wěn)定性試驗(yàn)

量取供試品溶液10 μL，分別在0、8、16、24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算對(duì)照品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，并統(tǒng)計(jì)出比值的RSD為193%，表明在24 h之內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性較好。

25重現(xiàn)性試驗(yàn)

取批號(hào)為20130902的SFPN樣品，制備6份供試品溶液，[JP2]按“13”節(jié)的條件對(duì)樣品中三七皂苷R1的含量進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算出樣品的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，并代入“22”節(jié)的回歸方程，計(jì)算出三七皂苷R1的平均含量為056 mg/g，并統(tǒng)計(jì)出含量的RSD為159%，表明本方法具有較好的重現(xiàn)性。

26加樣回收率試驗(yàn)

稱取批號(hào)為20131011的已知含量的SFPN樣品6份，每份02 g，按上述方法，制備樣品儲(chǔ)備液，取100 μL內(nèi)標(biāo)溶液和100 μL的供試品儲(chǔ)備液，加入適量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇定容至1 mL，溶解后，過045 μm微孔濾膜，得到供試品溶液，按上述方法操作，計(jì)算供試品溶液中三七皂苷R1的含量，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表1。

[F（W10][HT6H][J][WTH]表1三七皂苷R1的回收率測(cè)定結(jié)果（n=6[HTSS][STB][WTB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W3，W42。5，W32W]樣品號(hào)稱樣量（mg樣品含量（μg/mL加入量（μg/mL測(cè)得量（μg/mL回收率（%RSD（%

[BHDG12，W3，W42。5DW，W32W]1200111121122209821

[BHDW]22000611211222810179

320026112112229821

4200151121122229911

51999211211222610089

6199791121122199777

平均9933165[HJ][BG）F][F）]

27樣品含量測(cè)定

稱取不同批號(hào)的SFPN樣品3份，每份02 g，制備供試品溶液，按“13”節(jié)色譜條件進(jìn)行操作，計(jì)算出樣品的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，并代入“22”節(jié)的回歸方程，計(jì)算三七皂苷R1含量，結(jié)果見表2。

[F（W6][HT6H][J][WTH]表2田七花總皂苷中三七皂苷R1的含量（n=3[HTSS][STB][WTB]

[HJ5][BG（！][BHDFG12，W14，W15W]SFPN批號(hào)三七皂苷R1（mg/g

[BHDG12]20130502057

[BHDW]20130816055

20131112051[HJ][BG）F][F）]

3討論

田七花的組成成分復(fù)雜，含有大量色素，在測(cè)定三七皂苷R1時(shí)，必須排除主要基質(zhì)成分或色素成分的干擾。本研究參照Sun等所述方法[13]，以乙醚萃取去除葉綠素等脂溶性物質(zhì)，以正丁醇萃取出大部分的皂苷類物質(zhì)，再選用D101型大孔樹脂進(jìn)行柱層析，用水洗去多糖，最后收集90%乙醇洗脫液，此法可較好地對(duì)田七花皂苷類成分進(jìn)行富集和純化。

三七皂苷R1的最大吸收波長(zhǎng)為203 nm，由于SFPN含有多種成分，紫外末端吸收多，采用普通的HPLC紫外檢測(cè)器難以進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)，且專屬性較差。皂苷類化學(xué)成分極性大、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定，經(jīng)典的電子轟擊電離（EI對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析也很困難。使用ESI同時(shí)結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜分析，可以較快地獲得結(jié)構(gòu)信息。在選定內(nèi)標(biāo)物時(shí)，發(fā)現(xiàn)紫杉醇純度高、易保存，與被測(cè)成分的化學(xué)性質(zhì)相似，有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，穩(wěn)定性好，內(nèi)源物質(zhì)無(wú)干擾。本研究建立的采用負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)的HPLC-MS/MS分析方法，靈敏度高、重現(xiàn)性好，符合食品樣品分析的要求，較其他方法節(jié)省了大量的時(shí)間和成本[14]，可用于三七皂苷R1的定量分析，為不同田七花及其保健食品、藥品的含量測(cè)定提供方法學(xué)參考。

[HS22][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS]

[1][（#]蔣細(xì)旺 花草茶的種類、保健功能及使用[J] 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自科版石油/農(nóng)學(xué)中旬刊，2013，10（6：62-66

[2]周家明，崔秀明，張文斌，等 三七莖葉和花的食用考證[J] 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，23（5：39-40endprint

[3]高明菊，崔秀明，曾江，等 田七花的研究進(jìn)展[J] 人參研究，2009（2：5-8

[4]Jung H W，Seo U ，im J H，et al Flower extract of Panax notoginseng attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory response via blocking of NF-kappaB signaling pathway in murine macrophages[J] Journal of Ethnopharmacology，2009，122（2：313-319

[5]殷勤紅，朱艷琴，虞泓，等 三七花化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J] 光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28（3：1194-1197

[6]朱艷琴，殷勤紅，楊俊，等 超聲醇溶-紫外分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地三七花中總黃酮含量[J] 食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（1：187-189

[7]楊明晶，俞萍，陸羅定，等 三七花苷毒理安全性研究[J] 江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，21（6：12-14

[8]Yang W ，Bo T，Ji S，et al Rapid chemical profiling of saponins in the flower buds of Panax notoginseng by integrating MCI gel column chromatography and liquid chromatography/mass spectrometry analysis[J] Food Chemistry，2013，139（1/2/3/4：762-769

[9]沈嵐，馮怡，徐德生，等 比色法測(cè)定三七花中總皂苷的含量[J] 中成藥，2007，29（9：1368-1370

[10][（#]朱艷琴，殷勤紅，虞泓，等 HPLC法同時(shí)測(cè)定三七花中3種皂苷[J] 中成藥，2013，35（2：339-341

[11]沈嵐，馮怡，徐德生，等 反相高效液相色譜法測(cè)定田七花中三七皂苷R1的含量[J] 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（6：1482-1483

[12]國(guó)家藥典委員會(huì)中華人民共和國(guó)藥典：一部[M]2010版 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：11-12

[13]Sun H X，Ye Y P，Pan H J，et al Adjuvant effect of Panax notoginseng saponins on the immune responses to ovalbumin in mice[J] Vaccine，2004，22（29/30：3882-3889

[14]秦楓，于生蘭，高彥慧，等 HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定三七須根總皂苷中人參皂苷Rg1和Re的含量[J] 中國(guó)藥房，2010，21（31：2922-2924[HJ][FL]

[HT5”SS〗江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年第42卷第12期

[SQ5]

[HT6F]周霞，許維岸，韓宏巖 納米氧化鋅對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響[J] 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（12）：322-325endprint