停乳鏈球菌活菌和死菌對(duì)日本沼蝦機(jī)體SOD活性和MDA含量影響的比較

趙衛(wèi)紅　張余霞　於葉兵　王資生　齊志濤

摘要：將健康日本沼蝦[（140 ± 012 g]隨機(jī)分為3組，注射2針PBS的對(duì)照組，第1針注射PBS、第2針注射停乳鏈球菌活菌的感染組，第1針注射停乳鏈球菌死菌、第2針注射停乳鏈球菌活菌的免疫組，2針相隔24 h。第2針注射后6 h、12 h、24 h、5 d和10 d分別采集肝胰腺、肌肉和鰓組織，測(cè)定其中的總超氧化物歧化酶（T-SOD活性和丙二醛（MDA含量。試驗(yàn)結(jié)果顯示：感染組活菌注射6、12 h肌肉以及5 d肝胰腺中SOD活性相對(duì)于對(duì)照組均顯著升高（P<005；免疫組活菌注射6 h后肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性顯著高于感染組，而MDA含量顯著低于感染組（P<005；6、12、24 h肌肉、24 h肝胰腺、5 d鰓中SOD活性均為免疫組顯著高于感染組（P<005；12 h的肌肉和5 d的鰓中MDA含量，免疫組顯著小于感染組（P<005。結(jié)果表明，滅活鏈球菌注射日本沼蝦24 h后再注射活菌，6 h 后可提高日本沼蝦機(jī)體免疫活性，降低機(jī)體MDA含量。

關(guān)鍵詞：停乳鏈球菌；日本沼蝦；疫苗；總超氧化物歧化酶（T-SOD；丙二醛（MDA

中圖分類(lèi)號(hào)： S9454+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（201412-0284-03[HS][HT9SS]

[HJ14mm]

收稿日期：2014-11-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31101887）；江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：B2011419、B2012675）；江蘇省2011年企業(yè)博士聚集項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：趙衛(wèi)紅（1973—），女，江蘇東臺(tái)人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)動(dòng)物繁殖、營(yíng)養(yǎng)與免疫方面的教學(xué)與研究工作。Tel：（0515）88298190；E-mail：misszwh@163com。

通信作者：王資生。E-mail：wzs@yciteducn。[HJ]

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense，別稱(chēng)青蝦、河蝦，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種，具有較高的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并具有潛在的藥用價(jià)值[1]，由于其肉味鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，一直深受消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái)，隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的快速發(fā)展，規(guī)?；呙芏瑞B(yǎng)殖模式的普及，水產(chǎn)動(dòng)物間病原體交叉感染嚴(yán)重，細(xì)菌病等疾病的暴發(fā)制約著日本沼蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在我國(guó)一些水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)，均不同程度地暴發(fā)鏈球菌病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。大連某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生過(guò)對(duì)蝦鏈球菌病，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，廣東地區(qū)也出現(xiàn)南美白對(duì)蝦感染鏈球菌病例。雖然未見(jiàn)日本沼蝦養(yǎng)殖中鏈球菌病大規(guī)模暴發(fā)的報(bào)道，但是在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，停乳鏈球菌同樣對(duì)日本沼蝦具有較高的感染致死作用，因此，研究停乳鏈球菌對(duì)日本沼蝦免疫機(jī)能的影響對(duì)防范該菌所致疾病在蝦類(lèi)養(yǎng)殖中大規(guī)模暴發(fā)，進(jìn)一步探討甲殼動(dòng)物的免疫機(jī)制有著現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。超氧化物歧化酶（SOD是細(xì)胞內(nèi)最有效的抗氧化酶之一，SOD促進(jìn)生物體內(nèi) O-2[G-2]· [G-3]與H+反應(yīng)生成H2O2，從而降低 O-2[G-2]· [G-3]對(duì)生物體的傷害，是生物體內(nèi)清除活性氧從而保護(hù)機(jī)體組織的第1道防線。SOD 活性與甲殼動(dòng)物的免疫能力有重要關(guān)系[4-5]。生物膜中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA受到 O-2[G-2]· [G-3]攻擊，會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用，產(chǎn)生丙二醛（malondiadehyde，MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物，引起細(xì)胞損傷，最終降低甲殼動(dòng)物的免疫水平，因此MDA含量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映機(jī)體抗氧化能力[6]。筆者所在課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)給日本沼蝦注射一定劑量的停乳鏈球菌死菌后再進(jìn)行活菌感染，死亡率顯著低于單獨(dú)注射活菌（未發(fā)表。為了研究預(yù)先注射死菌降低其活菌感染死亡率的機(jī)理，本研究主要比較停乳鏈球菌死菌注射后感染活菌和活菌單獨(dú)感染的日本沼蝦肝胰腺、肌肉和鰓中T-SOD活性和MDA含量的變化，為日本沼蝦停乳鏈球菌疫苗研制提供理論支撐。

1材料與方法

11試驗(yàn)蝦及其養(yǎng)殖管理

從鹽城人民菜場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)日本沼蝦（11±02 g400尾，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d后選取規(guī)格整齊、活潑健壯個(gè)體進(jìn)行停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae，以下簡(jiǎn)稱(chēng)鏈球菌注射試驗(yàn)，試驗(yàn)期間投喂體重3%的鮮活碎河蚌肉，每天投喂2次。每天24 h充氧，試驗(yàn)期間水溫為20 ℃，試驗(yàn)蝦養(yǎng)殖于規(guī)格為100 L水族箱中，每箱60尾。

12鏈球菌的獲得和配制

鏈球菌來(lái)源于得病的鱘魚(yú)（sturgeon，從10條患病的鱘魚(yú)體內(nèi)分離獲得，通過(guò)生理、生化特性和分子分析確認(rèn)。

鏈球菌在24 ℃下于100 mL Todd Hewitt培養(yǎng)基（THB中振蕩培養(yǎng)24 h。10 000 r/min離心10 min后收集，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS，01 mol/L，pH值=70沖洗3遍后用PBS制成6×106 CFU懸液備用。40%的福爾馬林滅活活菌24 h獲得死菌。注射用菌液現(xiàn)配現(xiàn)用。

13菌種注射方案

試驗(yàn)分3組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行60尾蝦，均注射2針，2針注射間隔時(shí)間為24 h。第1組為對(duì)照組，注射2針PBS；第2組為感染組，第1針注射PBS，第2針注射 6×106 CFU 活菌；第3組為免疫組，第1針注射6×106 CFU死菌，第2針注射6×106 CFU活菌。第2腹甲和第3腹甲之間與身體呈45°角處進(jìn)行肌肉注射，注射劑量10 μL/尾。

14日本沼蝦組織的提取與處理

取樣前24 h停食，第2針注射6 h、12 h、24 h、5 d和10 d后取5尾試驗(yàn)蝦的肝胰腺、肌肉、鰓的組織，用于SOD活性和MDA含量的測(cè)定。測(cè)定時(shí)肌肉和鰓按重量體積比加生理鹽水制成10%的組織勻漿，肝胰腺制成5%的組織勻漿，6 000 r/min 離心15 min，上清液用于SOD活性和MDA含量的測(cè)定。endprint

15蛋白濃度的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒。原理：蛋白質(zhì)分子有-NH+3基團(tuán)，當(dāng)棕紅色的考馬斯亮藍(lán)顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，考馬斯亮藍(lán)染料上的陰離子與蛋白-NH+3結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過(guò)測(cè)定吸光度可計(jì)算出蛋白含量。

16SOD活性的測(cè)定

總SOD酶活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定，方法為黃嘌呤氧化法。SOD活性定義為1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活性單位（U。

17MDA含量測(cè)定

MDA含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定。其原理為過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸（thibabituric acid，TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，簡(jiǎn)稱(chēng)TBA法。

18數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，經(jīng)Excel2007初步整理后，用SPSS180對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，分析組間差異顯著性程度，顯著水平為P<005。

2結(jié)果與分析

21肌肉注射鏈球菌對(duì)日本沼蝦各組織SOD活性的影響

日本沼蝦肌肉注射鏈球菌活菌后各組織SOD活性變化如下：12 h和24 h肝胰腺中SOD活性和對(duì)照組的差異不大，5 d 后顯著升高（P<005，為對(duì)照組的9倍左右；肌肉中SOD活性在注射6 h達(dá)到最大值，為對(duì)照組的7倍左右；鰓中SOD活性注射后6 h、12 h、24 h和5 d變化不大（表1；10 d后所有注射活菌組肝胰腺中SOD活性均降為對(duì)照組的一半左右（表1。

感染組和免疫組SOD活性差異如下：6 h免疫組肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性均顯著高于感染組（P<005；所有時(shí)間段免疫組肌肉中SOD活性均高于感染組，其中6 h、12 h和24 h后2組差異顯著（P<005，5 d和10 d差異不顯著（P>005；24 h肝胰腺和5 d鰓中SOD活性免疫組顯著高于感染組（P<005（表1。[FL]

[F（W11][HT6H][J][WTH]表1鏈球菌對(duì)日本沼蝦組織中SOD活性的影響[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5。2，W50W]組織組別SOD活性相對(duì)于對(duì)照組的比值

[BHDWG12，W10。5W]6 h12 h24 h5 d10 d[BW]

[BHDG12，W5。2，W10。5DWW]肝胰腺感染組105±005bA146±002bA114±011bA899±020cD046±001aA

[BHDW]免疫組275±035cB144±046bA179±001bB912±010dD057±001aA

肌肉感染組743±035eD500±002dB121±005bA324±004cC043±002aA

免疫組1862±258dE698±027cC460±011bC410±039bC072±002aA

鰓感染組136±004bA128±001bA104±003bA139±002bA054±001aA

免疫組537±045dC122±012bA125±003bA235±003cB052±003aA[HJ][BGF]

注：表中數(shù)字后面的字母不同表示差異顯著（P<005，相同表示差異不顯著（P>005，其中小寫(xiě)字母表示同行數(shù)據(jù)之間比較，大寫(xiě)字母表示同列數(shù)據(jù)之間比較。[F]

[FL（22]22肌肉注射鏈球菌疫苗對(duì)日本沼蝦各組織MDA含量的影響

肌肉注射鏈球菌活菌對(duì)各組織中MDA含量的影響如下：6 h肝胰腺中MDA含量急劇增加，高達(dá)對(duì)照組的24倍左右，而12 h后肌肉中MDA含量顯著增加至對(duì)照組的464倍左右（P<005；24 h后肝胰腺和鰓中MDA含量均低于對(duì)照組，鰓中只有對(duì)照組的28%左右。

相同感染時(shí)間同組織內(nèi)感染組和免疫組MDA含量之間的比較結(jié)果為：注射6 h后感染組肝胰腺、肌肉和鰓中MDA含量均顯著大于免疫組（P<005；注射12 h后肝胰腺和鰓中則相反，感染組顯著小于免疫組（P<005；注射5 d免疫組鰓中MDA含量顯著高于免疫組（P<005（表2。[FL]

[F（W10][HT6H][J][WTH]表2鏈球菌對(duì)日本沼蝦組織中MDA含量的影響[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5。2，W50W]組織組別MDA含量相對(duì)于對(duì)照組的比值

[BHDWG12，W10。5W]6 h12 h24 h5 d10 d[BW]

[BHDG36mm，W5。2，W10。5DWW]肝胰腺感染組2461±101dE102±008bcA053±002aA087±001abA118±002cA

[BHDW]免疫組114±024bD295±012cC053±001aA131±001bC121±001bA

肌肉感染組023±003aB464±047cD127±006bB119±004bBC128±025bAB

免疫組007±001aA223±012cBC167±013bcB129±004bC142±008bA

鰓感染組065±002bC103±007bA028±001aA103±001bB228±001cC

免疫組019±002aB204±009bB041±001aA050±002aA189±009bBC[HJ][BGF]

注：表中數(shù)字后面的字母不同表示差異顯著（P<005，相同表示差異不顯著（P>005，其中小寫(xiě)字母表示同行數(shù)據(jù)之間比較，大寫(xiě)字母表示同列數(shù)據(jù)之間比較。[F]endprint

[FL（22]3討論

31鏈球菌活菌對(duì)日本沼蝦SOD活性和MDA含量

O-2[G-2]· [G-3]能夠與生物膜不飽和脂肪酸進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化，形成細(xì)胞損傷，造成功能性障礙，甚至?xí)菇M織變性壞死，破換機(jī)體代謝平衡。SOD是機(jī)體內(nèi)一種能夠直接清除 O-2[G-2]· [G-3]的抗氧化酶。機(jī)體清除 O-2[G-2]· [G-3]的能力可以由SOD活性的高低間接反映，機(jī)體受到細(xì)菌感染時(shí)，體內(nèi)SOD活性會(huì)發(fā)生改變。本試驗(yàn)結(jié)果表明，感染組注射鏈球菌活菌感染10 d后機(jī)體肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性均低于對(duì)照組，這和羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii感染莫格球擬酵母后[7]和斑節(jié)對(duì)蝦Penaeus monndon感染典型弧菌后[8]的研究結(jié)果類(lèi)似。日本沼蝦注射鏈球菌活菌6 h肌肉中SOD活性達(dá)到對(duì)照組的7倍左右，6～24 h肌肉中SOD活性隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。這一結(jié)果與鎘對(duì)克氏原螯蝦Procambarus clarkii脅迫中的報(bào)道結(jié)果類(lèi)似，鎘脅迫24 h克氏原螯蝦體內(nèi)SOD活性達(dá)到最大值，隨著作用時(shí)間的推移，SOD活性逐漸降低[9]。機(jī)體遇到不良環(huán)境脅迫會(huì)做出應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫因子，如促使SOD活性急劇增加以清除體內(nèi)脅迫產(chǎn)生的 O-2[G-2]· [G-3]?；罹腥?、12 h日本沼蝦肌肉中SOD活性均顯著高于肝胰腺和鰓，這和本試驗(yàn)中肌肉注射的感染方式有關(guān)。感染至5 d肝胰腺中SOD活性顯著升高，肝胰腺是甲殼動(dòng)物最重要的免疫器官，面對(duì)細(xì)菌的侵染，肝胰腺中SOD活性升高，擔(dān)負(fù)起清除體內(nèi) O-2[G-2]· [G-3]的作用。

MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，在組織中的含量可以表現(xiàn)生物體細(xì)胞過(guò)氧化的水平。注射鏈球菌活菌6 h后肝胰腺中MDA含量急劇增加，而6 h后肌肉中MDA反而低于對(duì)照組，在12 h后肌肉中MDA含量才急劇增加。機(jī)體MDA含量與多種因素有關(guān)，機(jī)體在不良環(huán)境刺激下會(huì)產(chǎn)生 O-2[G-2]· [G-3]， O-2[G-2]· [G-3]含量與機(jī)體MDA含量有關(guān)，同時(shí) O-2[G-2]· [G-3]與SOD活性有關(guān)，日本沼蝦注射活菌后6 h肌肉中SOD活性急劇增加，可能是此時(shí)MDA含量降低的原因。MDA短時(shí)間內(nèi)在肝胰腺中大量增加，可能有以下幾個(gè)方面的原因：首先肝胰腺是日本沼蝦最重要的免疫器官，是 O-2[G-2]· [G-3]首先攻擊的部位；另外肝胰腺含有大量的不飽和脂肪酸，這些不飽和脂肪酸在 O-2[G-2]· [G-3]的氧化下會(huì)產(chǎn)生大量的MDA，而此時(shí)檢測(cè)到機(jī)體肝胰腺中的SOD活性相對(duì)于對(duì)照組變化不大，沒(méi)有起到應(yīng)對(duì)短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的 O-2[G-2]· [G-3]氧化的作用，上述幾個(gè)方面綜合作用，促使肝胰腺中MDA含量大量增加。

有研究表明，MDA含量與外界刺激物具有劑量-時(shí)間效應(yīng)。如沼水蛙蝌蚪MDA 含量隨著有機(jī)磷農(nóng)藥作用時(shí)間與濃度的增加而增加[10]，劍尾魚(yú)（Xiphophorushelleri heckel肝臟中MDA含量在整個(gè)汞染毒過(guò)程中隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)升高[11]。本試驗(yàn)中日本沼蝦肝胰腺中MDA 的含量在鏈球菌活菌感染6 h達(dá)到最高，在肌肉中MDA含量在12 h達(dá)到最高，隨后降低，這一結(jié)果與王奇等[12]和羅義等[13]的研究結(jié)果相似，MDA在24 h達(dá)到最高，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，MDA 含量逐漸下降。這表明6×106 CFU的鏈球菌活菌注射日本沼蝦發(fā)生的氧化損傷是可逆的。

32滅活鏈球菌疫苗對(duì)日本沼蝦SOD活性及MDA含量的影響

筆者所在課題組在前期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)福爾馬林滅活鏈球菌注射后會(huì)大大降低其活菌感染后的死亡率（未發(fā)表。滅活疫苗是采用物理或者化學(xué)方法殺死具有感染性的完整病原生物，使該病原生物失去傳染其他生物體能力的同時(shí)保留其抗原性，并能夠用于預(yù)防免疫的生物制品制備。水產(chǎn)上研究較多的有弧菌滅活苗、嗜水氣單胞菌疫苗、鏈球菌疫苗等[14]。我國(guó)有關(guān)滅活疫苗在水產(chǎn)上的研究主要集中在魚(yú)類(lèi)，且目前大部分還停留在疫苗對(duì)死亡率的影響方面，有關(guān)其機(jī)理研究較少[14]。本試驗(yàn)中，用福爾馬林滅活的停乳鏈球菌作為抗鏈球菌的疫苗，注射24 h后感染鏈球菌活菌，比較其與單獨(dú)感染活菌不同時(shí)間段組織中SOD活性和MDA含量的變化，初步探討滅活鏈球菌對(duì)日本沼蝦免疫機(jī)能的影響。本試驗(yàn)中免疫組注射活菌6 h后肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性均顯著高于對(duì)照組，MDA含量顯著低于對(duì)照組。這表明疫苗在注射30 h后對(duì)日本沼蝦產(chǎn)生了免疫保護(hù)作用，當(dāng)機(jī)體再次受到鏈球菌侵襲時(shí)，機(jī)體迅速做出反應(yīng)，產(chǎn)生大量SOD，消滅體內(nèi)多余 O-2[G-2]· [G-3]，降低MDA含量。滅活菌作為疫苗注射可以提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫機(jī)能的報(bào)道在虹鱒（Oncorhynchus mykiss中也有報(bào)道，Ispir等[15]制備了福爾馬林滅活耶爾森氏菌疫苗，發(fā)現(xiàn)這種疫苗能夠提高虹鱒的吞噬細(xì)胞活性。此外陳昌福[16]通過(guò)對(duì)鯉魚(yú)母源的免疫研究，證明了雌親魚(yú)不僅可以產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，而且其凝集抗體可以傳遞給子代并對(duì)初生幼體產(chǎn)生作用。

綜上所述，停乳鏈球菌活菌注射6 h肌肉中SOD活性大量增加，5 d肝胰腺中SOD活性大量增加，6 h肝胰腺中MDA含量大量增加。滅活鏈球菌注射后24 h再注射鏈球菌活菌，6 h后肝胰腺、肌肉和鰓中SOD活性顯著高于單獨(dú)注射鏈球菌活菌，MDA含量顯著低于單獨(dú)注射鏈球菌活菌。

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