廣藿香不同組織總RNA提取方法的篩選與優(yōu)化

陳英　吳友根　楊東梅　張軍鋒　林尤奮　胡新文

摘要：分別采用Trizol法、改良Trizol法、CTAB法、改良CTAB法和異硫氰酸胍-SDS法等5種方法提取廣藿香葉、莖、根及愈傷組織的總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜檢測(cè)其提取效果。結(jié)果表明，Trizol法適用于廣藿香葉片總RNA的提取，改良CTAB法適用于廣藿香莖和愈傷組織總RNA的提取，而廣藿香根總RNA的提取宜用改良Trizol法。RT-CR檢測(cè)結(jié)果表明，廣藿香各組織的總RNA可直接用于分子克隆和基因表達(dá)分析等分子生物學(xué)試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：廣藿香；總RNA；提取方法；Trizol法；CTAB法；異硫氰酸胍-SDS法

中圖分類號(hào)：Q522文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：002-302（204）2-0053-03

廣藿香[ogostemon cablin （Blanco） Benth]為唇形科刺蕊草屬植物，原產(chǎn)于東南亞地區(qū)如馬來西亞、菲律賓、印度尼西亞等國(guó)，在我國(guó)引種可追溯到梁代或以前。我國(guó)主要栽培地為海南和廣東2省，廣西、福建及臺(tái)灣等地也有少量栽培。廣藿香以干燥地上部分入藥，是我國(guó)常用的芳香化濕類中藥之一，常用于治療濕濁中阻、脘痞嘔吐、暑濕倦怠、胸悶不舒、寒濕閉暑、腹痛吐瀉、鼻淵頭痛等疾[2]。廣藿香不僅是30多種中成藥的主要原料，而且以其提取的廣藿香油還是醫(yī)藥和輕化工業(yè)的重要原料[3]。從植物組織中提取完整性好、純度高的RNA，是開展植物分子生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，是研究基因克隆及表達(dá)分析的重要環(huán)節(jié)[4]。但廣藿香各組織總RNA提取方法尚鮮見報(bào)道，且廣藿香富含多糖等次生代謝產(chǎn)物[5]，對(duì)總RNA提取的影響較大。本研究以廣藿香葉、莖、根及愈傷組織為試驗(yàn)材料，對(duì)比Trizol法、改良Trizol法、CTAB法、改良CTAB法和異硫氰酸胍-SDS法等5種方法的提取效果，以期篩選廣藿香各組織總RNA提取的方法，為廣藿香的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

材料與試劑

供試的廣藿香植物材料采于海南大學(xué)園藝園林學(xué)院廣藿香資源圃，采集生長(zhǎng)期為4個(gè)月的廣藿香葉、莖、根，采后用液氮冷凍處理，-70 ℃保存，備用。供試的廣藿香愈傷組織由廣藿香葉誘導(dǎo)，取生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織作RNA提取的材料。

試驗(yàn)所用的主要試劑有Trizol（Invitrogen公司）、DEC（Sigma公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）、SDS、CTAB、異硫氰酸胍（北京鼎國(guó)公司），其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純，引物由北京諾賽基因組研究有限公司合成。試驗(yàn)中所用槍頭、CR管、離心管等塑料耗材均用0% DEC水浸泡處理過夜，并于2 ℃ 下高壓滅菌20 min，烘干，備用；用于RNA提取的研缽、玻璃器皿均在80 ℃下烘烤6～8 h，備用。

2方法

2 RNA提取方法采用傳統(tǒng)Trizol法[6]、改良Trizol法[6]、傳統(tǒng)CTAB法[7]、改良CTAB法[8]和異硫氰酸胍-SDS法[9]。

22 RNA質(zhì)量與濃度檢測(cè)取5 μL提取的廣藿香各組織總RNA溶液于2%瓊脂糖凝膠在×TBE緩沖液中電泳，檢測(cè)RNA的完整性。并取 μL RNA樣品，用DEC處理水稀釋50倍，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)D260 nm、D280 nm，并計(jì)算D260 nm/D280 nm，以確定其純度及得率。

23 RT-CR分析 反轉(zhuǎn)錄參照Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。通過RT-CR擴(kuò)增看家基因GADH基因，CR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)目的條帶。上游引物為5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′；下游引物為5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。CR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存。

2結(jié)果與分析

2廣藿香各組織總RNA完整性的檢測(cè)

由圖可知，5種方法均能從廣藿香葉中獲得RNA，且用這5種方法所得RNA的28S、8S、5S等3條條帶都較清晰，說明質(zhì)量較好，但以Trizol法所得RNA效果最好，表現(xiàn)為28S條帶的亮度約為8S的2倍，說明雜質(zhì)含量較少。除Trizol法外，其余4種方法均能從廣藿香莖中獲得RNA，但除改良CTAB法以外，其他3種方法獲得的RNA均有DNA污染，且改良Trizol法和異硫氰酸胍-SDS法所得RNA條帶較模糊，說明存在輕度降解。5種方法均能從廣藿香根中獲得RNA，且用這5種方法所得RNA的28S、8S、5S等3條條帶都較清晰，但Trizol法所得RNA條帶較暗，說明得率較低，改良CTAB法所得RNA 5S條帶較亮，說明存在降解，CTAB法和異硫氰酸胍-SDS法所得RNA存在DNA污染，改良Trizol法所得RNA條帶清晰，雖亮度不及除Trizol法外的其他3種方法，但無DNA污染。5種方法均能從廣藿香愈傷組織中獲得RNA，但Trizol法和改良Trizol法所得RNA條帶模糊，說明存在降解，CTAB法所得RNA條帶亮度較暗，說明得率較低，改良CTAB法和異硫氰酸胍-SDS法所得RNA 條帶清晰，亮度適中，說明質(zhì)量較好。[FL）]

[FK（W6][TWYGtif][FK）]

[FL（2K2]22廣藿香各組織總RNA的純度和產(chǎn)率

由表可知，5種方法從廣藿香葉中所得RNA的 D260 nm/D280 nm 的值均大于8，說明RNA的純度較高，樣品中存在的多糖、多酚或蛋白等雜質(zhì)較少，其中Trizol法和CTAB法所得RNA的D260 nm/D280 nm 的值較大，分別為99、20，但Trizol法所得RNA的產(chǎn)率較CTAB法大。除Trizol法未能從廣藿香莖中提取出RNA外，其余4種方法從莖中所得RNA的D260 nm/D280 nm 的值均大于8，但以改良Trizol法最高，為88，且其得率最高，為2720 μg/g。除改良CTAB法外，其余4種方法從廣藿香根中所得RNA的D260 nm/D280 nm 的值均大于8，改良CTAB法為76，說明RNA樣品中存在蛋白或其他有機(jī)物的污染，RNA得率以CTAB法最高，為33920 μg/g。改良CTAB法和異硫氰酸胍-SDS法從廣藿香愈傷組織中所得RNA的D260 nm/D280 nm 的值大于8，得率以改良CTAB法較高，這可能是由于異硫氰酸胍-SDS法沉淀次數(shù)較多，雖然使得多糖、蛋白等雜質(zhì)得以沉淀，但同時(shí)也使部分RNA一同被沉淀下來，因此RNA的產(chǎn)率偏低。[FL）]

[FK（W9][HT6H][Z][WTHZ]表不同方法提取的廣藿香葉、莖、根及愈傷組織總RNA的純度及產(chǎn)率[HTSS][STBZ][WTBZ]

[H5][BG（！][BHDFG3，WK8，WK52W]提取方法[ZB（][BHDWG2，WK26。2W]D260 nm/D280 nm 的值總RNA產(chǎn)率（μg/g）

[BHDWG2，WK62。8W][XXZSX2-ZSX252]葉莖根愈傷組織[XXZSX2-ZSX252]葉莖根愈傷組織[ZB）W]

[BHDG2，WK8ZQ2，WK62。8W]Trizol法99— 847628400— 400022640

[BHDW]改良Trizol法8288 8479286402720987024960

[BH]CTAB法2088273 2604023040 339208770

[BH]改良CTAB法80 84 76 84340087603384026920

[BH]異硫氰酸胍-SDS法8883 884 24520245403048025200[H][BG）F]

注：“—”表示未得到RNA，說明該法不適宜。[FK）]

[FL（2K2]23 RT-CR擴(kuò)增結(jié)果

為了驗(yàn)證從廣藿香不同組織中獲得的總RNA的質(zhì)量，對(duì)Trizol法提取的廣藿香葉、改良CTAB法提取的廣藿香莖和愈傷組織及改良Trizol法提取的廣藿香根的總RNA反轉(zhuǎn)錄后，通過RT-CR擴(kuò)增看家基因GADH基因，獲得496 bp的特異目的條帶（圖2），與預(yù)期目的基因片段大小一致，條帶明亮清晰，說明從廣藿香葉、莖、根、愈傷組織所提取的總RNA樣品質(zhì)量好，能夠用于后期的分子生物學(xué)試驗(yàn)。

3結(jié)論與討論

目前，從植物中提取RNA有多種方法[0-7]，不同物種或同種植物不同器官或組織的最佳提取方法存在差異。為確保獲得高質(zhì)量的RNA并達(dá)到在相關(guān)研究中的要求，有必要針對(duì)

[FK（W3][TWYG2tif；S2mm][FK）]

廣藿香不同器官或組織篩選出最佳RNA提取方法。蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)的污染是影響RNA提取質(zhì)量的重要因素[8]。因?yàn)槎喾友趸负蚏Nase均為蛋白質(zhì)；多糖的許多理化性質(zhì)與RNA相似，在提取過程中很難將其與RNA分開，去除多糖的同時(shí)RNA也會(huì)被除去，從而導(dǎo)致RNA產(chǎn)量減少；酚類物質(zhì)經(jīng)磨樣處理后會(huì)釋放出來，易氧化褐變，被氧化后的酚類物質(zhì)與RNA結(jié)合，使RNA喪失活性。廣藿香不同組織或器官中多酚、多糖、蛋白質(zhì)和水分含量與樣品得率均不完全相同，這些對(duì)廣藿香不同組織或器官中RNA的提取均有不同程度的影響。

對(duì)本研究所用的5種RNA提取方法進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，Trizol法提取RNA操作簡(jiǎn)便，只需～2 h，其在茶樹、甜瓜、芒果等許多植物RNA提取中都取得了良好的效果[9-20]。但筆者發(fā)現(xiàn)這種方法只有在廣藿香葉中提取到的RNA質(zhì)量較好，而在其他組織中提取的RNA質(zhì)量較其他方法差，甚至提取不到RNA。這可能主要是因?yàn)樵撎崛》椒ú僮鬟^于簡(jiǎn)單，無法有效地去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。改良Trizol法中加入了強(qiáng)還原劑β-巰基乙醇，有效地抑制了酚類物質(zhì)的氧化，同時(shí)還加入了絡(luò)合物V，使其與酚類物質(zhì)形成螯合物，從而有效去除酚類物質(zhì)。該方法在三色堇、香蕉等多種植物RNA提取中都取得了良好的效果[8]，但本研究結(jié)果表明其在廣藿香莖和愈傷組織中提取的RNA均存在輕微的降解現(xiàn)象，可能是由材料本身的原因造成的。CTAB不僅對(duì)植物細(xì)胞具有較好的裂解作用，而且還能有效分離核蛋白與核酸的復(fù)合物，同時(shí)和巰基乙醇聯(lián)合作用變性蛋白，從而有效抑制RNA酶活性。用CTAB作為陽(yáng)離子表面活性劑成分已從葡萄、蘋果、棉花、瓜葉菊、矮牽牛等多種植物中分離出高質(zhì)量的RNA[2-22]。本試驗(yàn)所用的改良CTAB法對(duì)廣藿香莖和愈傷組織RNA的提取效果均優(yōu)于其他幾種方法。異硫氰酸胍和SDS均為強(qiáng)蛋白變性劑，能有效鈍化RNase[23]，異硫氰酸胍-SDS法在一些內(nèi)源RNase較活躍的RNA提取中取得了良好的效果[9]。但本研究結(jié)果表明，其對(duì)于廣藿香的4種組織均不是最佳的提取方法，原因是不能有效地去除DNA污染，還需后續(xù)的RNA純化步驟，這使得后續(xù)試驗(yàn)復(fù)雜化。是否存在蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，DNA污染情況及得率高低是判別RNA質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。綜合以上3個(gè)指標(biāo)，本研究結(jié)果表明，Trizol法是從廣藿香葉中提取總RNA的最佳選擇，從廣藿香莖和愈傷組織中提取總RNA適宜選擇改良CTAB法，而要從廣藿香根中獲得RNA，則改良Trizol法較好。本研究結(jié)果還進(jìn)一步說明了同一種植物的不同器官和組織，其RNA提取的最適宜方法存在差異。

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