巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制*

張怡評 ，陳偉珠 ，方華 ，謝全靈 ，陳暉 ，洪專 ，易瑞灶 ，吳皓

(1.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

巖藻黃質(zhì)(fucoxanthin，亦稱褐藻黃素)是從可食用褐藻中，如裙帶菜(Undaria pinnatifi da)、海帶(Laminaria japonica aresch)和馬尾藻(Sargassum fulvellum)等提取出來的天然類胡蘿卜素。目前已經(jīng)證實(shí)巖藻黃質(zhì)具有多種生物學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化、減肥等［1–5］，其潛在的活性也正在被科學(xué)家們積極探求之中，目前己成為當(dāng)今海洋藥物研究與開發(fā)的熱點(diǎn)之一。然而，由于技術(shù)難度等問題，目前國內(nèi)尚無巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品。筆者從海帶中提取分離純化獲得高純巖藻黃質(zhì)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究，為海帶及巖藻黃質(zhì)制劑的后續(xù)開發(fā)研究提供重要的指標(biāo)性成分。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC–2010AD型，附帶二元高壓梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器，日本島津公司；

紅外光譜儀：Nicolet Ftir–670 型，美國Thermo Scientifi c 公司；

高分辨質(zhì)譜儀：Lct PremierTMXE型，美國Waters公司；

天平：AL／104型，瑞士梅特勒–托利多集團(tuán)；

純水機(jī)：Milli–Q，美國 Millipore公司；

甲醇：色譜純，德國默克公司；

實(shí)驗(yàn)用水均來自Milli–Q純水系統(tǒng)。

1．2 巖藻黃質(zhì)樣品的制備

以海帶為原料，經(jīng)乙醇提取、硅膠柱層析、高效液相色譜制備分離、濃縮、冷凍干燥得巖藻黃質(zhì)高純單體。

1．3 定性分析

采用紅外吸收光譜、高分辨質(zhì)譜及核磁共振譜等對巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性分析。

1．4 定值分析

采用高效液相色譜–紫外檢測(HPLC–UV)法進(jìn)行定值分析。

1.4.1 色譜條件

色譜柱：依利特ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司)；流動相：甲醇–水(體積比為90∶10)，流速為1.0 mL／min；檢測波長：450 nm；檢測器：紫外檢測器；進(jìn)樣體積：10 mL。

1.4.2 樣品配制

打開樣品瓶蓋子后，精密稱取巖藻黃質(zhì)適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度約為20 μg／mL的樣品溶液，按照1.4.1色譜條件進(jìn)行純度檢測，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3次。

1．5 均勻性檢驗(yàn)

按照 GB／T 15000.3–2008［6］規(guī)定，確定抽樣數(shù)目為15個，采用單因素多水平試驗(yàn)方差分析法對巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗(yàn)，測定方法采用HPLC–UV法，每個樣品重復(fù)測定3次。檢測數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行分析。

1.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

為了考察樣品的穩(wěn)定性，確定其有效期，取本標(biāo)準(zhǔn)樣品模擬上市包裝，進(jìn)行–18℃條件下的24個月長期試驗(yàn)。分別于0，6，12，18，24個月取樣檢測，通過考察標(biāo)準(zhǔn)樣品純度的變化來研究樣品的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性檢測方法與均勻性檢測方法相同，均采用HPLC–UV法，每份樣品連續(xù)進(jìn)樣兩次，然后用歸一法求出其純度的平均值。

2 結(jié)果與討論

2．1 巖藻黃質(zhì)的定性分析

巖藻黃質(zhì)通過紅外光譜、高分辨質(zhì)譜及核磁共振譜進(jìn)行定性分析［7］。

2.1.1 巖藻黃質(zhì)的紅外光譜分析

巖藻黃質(zhì)的紅外光譜數(shù)據(jù)見表1。紅外光譜的數(shù)據(jù)解析說明結(jié)構(gòu)中含有羥基(—OH)，亞甲基 (—CH2—)，酯鍵 (—COO—)，α，β-不飽和羰基(—CH=CH—C=O)，三元環(huán)醚，共軛雙鍵以及反式雙鍵，分別為巖藻黃質(zhì)上特定的官能團(tuán)，具體見表1。

表1 巖藻黃質(zhì)紅外光譜數(shù)據(jù)

2.1.2 巖藻黃質(zhì)的高分辨質(zhì)譜分析

巖藻黃質(zhì)化合物加鈉離子［C42H58O6+Na］+的理論精確質(zhì)量數(shù)為681.4131，高分辨質(zhì)譜測得的精確質(zhì)量數(shù)為681.4137，兩者數(shù)據(jù)一致，可以確認(rèn)該化合物的分子式為C42H58O6。

2.1.3 巖藻黃質(zhì)的核磁共振譜分析

化合物巖藻黃質(zhì)的分子式為C42H58O6，則不飽和度Ω=14。通過分析13C NMR和DEPT譜圖可知，14個不飽和度分別是由9個共軛雙鍵、1個酮羰基、1個乙酰氧基、1個環(huán)氧和2個六元環(huán)組成。進(jìn)一步對譜圖進(jìn)行分析可知，化合物巖藻黃質(zhì)含有 11 個 CH3，5 個 CH2，2 個次甲基 (CH)，3 個—CH= CH— ，4 個和2個羰基(C=O)以及5個季碳(C)。結(jié)合1H NMR和HMQC譜圖，巖藻黃質(zhì)含有 5個亞甲基 (CH2)。δ 2.59和 δ 3.65(d，J=18.4 Hz)可歸屬于7位碳上的兩個質(zhì)子；δ 1.35～1.41(m，1H)和δ 1.51(1H)可歸屬于六元環(huán)2位碳上的直立鍵和平伏鍵質(zhì)子；δ 1.76(1H)，δ 2.31 (1H)可歸屬于六元環(huán)4位碳上的直立鍵和平伏鍵質(zhì)子；δ 1.48(1H)，δ 2.00(1H)可歸屬于另一個六元環(huán)2'位碳上的直立鍵和平伏鍵質(zhì)子；δ 1.54(1H)，δ 2.30(1H)可歸屬于另一個六元環(huán)4'位碳上的直立鍵和平伏鍵質(zhì)子?；衔锖?個飽和次甲基CH，即δ 3.82歸屬為3位質(zhì)子，δ 5.38歸屬為3'位質(zhì)子，另外還有11個不飽和雙鍵上的次甲基質(zhì)子在低場出現(xiàn)峰δ 7.16～6.06(11H)，它們分別歸屬于 10，11，12，14，15，8'，10'，11'，12'，14'，15'位 的 雙 鍵 氫。10 個 甲 基質(zhì)子單峰 δ 1.99×2，δ 1.94，δ 1.81(12H，s，CH3×4)和 δ 1.38，δ 1.35，δ 1.22，δ 1.07，δ 1.03，δ 0.96(18H，CH3×6) 分 別 歸 屬 于 20，20'，19，19'，18'，16'，18，17'，16，17位的甲基。根據(jù) HMBC 可知，峰 δ 2.04(s，CH3)歸屬于22'的甲基質(zhì)子與21'的酯鍵組成的一個乙酰氧基片段，位于六元環(huán)直立鍵位置上。在13C NMR 和DEPT 中顯示巖藻黃質(zhì)含有11個CH3，5個 CH2，13個 CH 以及 13個季碳。HMQC譜顯示11個CH3的碳原子與它們的質(zhì)子對應(yīng)，δ 25.0歸屬為16位碳，δ 28.1歸屬為17位碳，δ 21.1歸屬為18位碳，δ 11.8歸屬為19位碳，δ 12.9 歸屬為20位碳，δ 29.2歸屬為16'位碳，δ 32.1歸屬為17'位碳，δ 31.3歸屬為18'位碳，δ 14.0歸屬為19'位碳，δ 12.8歸屬為20'位碳，δ 21.4歸屬為22'位碳。5個CH2的碳原子與它們的質(zhì)子對應(yīng)，δ 47.1歸屬為2位碳，δ 41.6歸屬為4位碳，δ 40.8歸屬為7位碳，δ 45.4歸屬為2'位碳，δ 45.2歸屬為4'位碳。13個CH由2個—O—CH (δ 64.3歸屬為3位碳，δ 68.0歸屬為3'位碳)和11個烯碳組成，這11個烯碳是3個—CHCH—(δ 123.4歸屬為11位碳，δ 129.4歸屬為12位碳，δ 128.5歸屬為15位碳，δ 132.5歸屬為 15'位碳，δ 136.6歸屬為 11'位碳，δ 132.2 歸屬為 12'位碳 )，4 個(δ 139.1 歸屬為10位碳，δ 125.7歸屬為14位碳，δ 137.1歸屬為 10'位碳，δ 139.1歸屬為 14'位碳 )和 1個歸屬為8'位碳)。13個季碳中，2個為羰基的碳(δ 197.8歸屬為8位碳，δ 170.5歸屬為21'位碳)；5個為飽和烷烴的季碳(δ 35.1歸屬為1位碳，δ 66.2歸屬為5位碳，δ 67.1歸屬為6位碳，δ 35.8歸屬為1'位碳，δ 72.6歸屬為5'位碳)；5個為烯烴的季碳(δ 134.5歸屬為9位碳，δ 135.4歸屬為13位碳，δ 132.5歸屬為9'位碳，δ 138.1歸屬為13'位碳，δ 117.5歸屬為6'位碳)和1個雙烯碳 (δ 202.3 歸屬為 7'位碳 )。

HMBC譜顯示2位碳與16，17位質(zhì)子有相關(guān)；4位碳與3，18位質(zhì)子有相關(guān)；8位碳與7，10，19位質(zhì)子有相關(guān)；11位碳與10，12位質(zhì)子有相關(guān)；1'位碳與 16'，17'位質(zhì)子有相關(guān)；20'位碳與 12'，14'位質(zhì)子有相關(guān)。其余碳與質(zhì)子的相關(guān)性均證實(shí)了前述碳與質(zhì)子的歸屬。

綜上所述，樣品的核磁共振氫譜給出了甲基、亞甲基、次甲基、羰基等信息，各質(zhì)子的化學(xué)位移值與文獻(xiàn)一致；核磁共振碳譜、DEPT、HMQC、HMBC譜顯示碳的類型與該化學(xué)結(jié)構(gòu)相符，相關(guān)譜均有合理對應(yīng)點(diǎn)，各碳的化學(xué)位移值與文獻(xiàn)一致［8–9］，結(jié)果見表2。

表2 巖藻黃質(zhì)的核磁共振數(shù)據(jù)

續(xù)表2

綜上所述，從樣品的紅外光譜、高分辨質(zhì)譜和核磁共振譜證明了所研制的樣品是巖藻黃質(zhì)。

2．2 均勻性試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性檢驗(yàn)是標(biāo)準(zhǔn)樣品研制過程中不可缺少的程序，因此在對樣品進(jìn)行分裝后，對巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗(yàn)，均勻性檢驗(yàn)結(jié)果與方差分析結(jié)果分別見表3、表4。

表3 巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品純度均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 %

表4 方差分析結(jié)果

2．3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本標(biāo)準(zhǔn)樣品，模擬上市包裝，在溫度為–18℃的條件下放置 24 個月，分別于 0，6，12，18，24 個月取樣，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目檢測，試驗(yàn)結(jié)果見表5。根據(jù)GB／T 15000–2008 《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》的要求，采用直線模型作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，對長期穩(wěn)定性獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表5 巖藻黃質(zhì)樣品在–18℃儲存條件下的穩(wěn)定性

斜率：

式中：Y = 99.4020，X=12。

截距：b0= Y - b1X = 99.3600。直線上點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

則s=0.064 897%，與斜率相關(guān)的不確定度：

自由度為n–2和95%置信水平的t因子t0.95,n-2＝ 2.776。t0.95,n-2s(b1)＝ 0.009 556， 由 于，故斜率是不顯著的，因而未觀測到不穩(wěn)定性。

長期試驗(yàn)穩(wěn)定性的不確定度：

usts＝s(b1)t＝0.003 425×24＝0.09%

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，巖藻黃質(zhì)在–18℃下保存2年仍穩(wěn)定。

2．4 定值結(jié)果及其不確定度評定

巖藻黃質(zhì)的檢測有HPLC–UV法［10］、紫外分光光度法［11］。但是尚無統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，由于分光光度法靈敏度較低，且主要是檢測一類物質(zhì)，而高效液相色譜法靈敏度較高，且具有較強(qiáng)的專屬性，因此采用高效液相色譜–紫外檢測法［10］進(jìn)行定值分析。

2.4.1 定值結(jié)果

本標(biāo)準(zhǔn)樣品按照GB／T 15000.3–2008標(biāo)準(zhǔn)要求，采用多個實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值，選擇獲得國家或部門認(rèn)可的具備資質(zhì)的8家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品定值。隨機(jī)抽取8瓶樣品，每家實(shí)驗(yàn)室送1瓶，采用HPLC–UV法進(jìn)行測定，應(yīng)用面積歸一法進(jìn)行定值，定值結(jié)果見表6。

表6 定值結(jié)果匯總 %

匯集各家實(shí)驗(yàn)室的檢測數(shù)據(jù)后，對每家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)按大小順序排列，用Grubb’s法和峰度法正態(tài)性檢驗(yàn)組內(nèi)數(shù)據(jù)的異常值，結(jié)果沒有異常值。所有數(shù)據(jù)再用Grubb’s法對每家實(shí)驗(yàn)室的平均值進(jìn)行檢驗(yàn)，將其看成一組測定值進(jìn)行異常值檢驗(yàn)，結(jié)果無異常值。因此將各家實(shí)驗(yàn)室測得的數(shù)據(jù)作為無偏估計值，計算8家測定結(jié)果的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。然后對各實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s進(jìn)行Cochran檢驗(yàn)，計算統(tǒng)計量：

式中：si——各實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

smax——si中的最大值。

C8，6(0.05)=0.668，C ＞ C8，3(0.05)，表 明 各 實(shí) 驗(yàn) 室間的測量不屬于等精度測量，因此計算加權(quán)平均值作為巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果，總平均值x=99.53%。

2.4.2 定值結(jié)果的不確定度評定

根據(jù)GB／T 15000.3–2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成。標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測量不確定度u由標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗(yàn)的不確定度ux、均勻性檢驗(yàn)的不確定度ubb、穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度usts組成。依據(jù)全部測定結(jié)果，計算巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度。

(1)標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗(yàn)引入的不確定度ux，按照加權(quán)法計算得到標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的不確定度ux=0.05%。

(2)均勻性檢驗(yàn)引入的不確定度ubb。瓶間方差：

式中 MSamong，MSwithin來自表 4。

瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差：ubb=sA=0.03%。

(3)穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度usts。由2.3穩(wěn)定性檢驗(yàn)可知usts=0.09%。標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度：

擴(kuò)展不確定度：U95=ku=1.96×0.11%=0.22%。巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值定值結(jié)果：99.53%±0.22%(置信度為95%，k=1.96)

3 結(jié)語

研制了巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品，對其進(jìn)行了均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察，考察結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)樣品符合標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性與穩(wěn)定性的要求。研制的巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品對巖藻黃質(zhì)相關(guān)制劑等方面的測量和科學(xué)研究提供了技術(shù)支撐和量值溯源保證。

［1］ 湯潔.用超臨界CO2技術(shù)制備巖藻黃質(zhì)的方法［P］.中國：200810168283.5，2009–6–3.

［2］ Koyagagi S, Tanigawa N, Nakagawa H, et al. Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and antitumor activities［J］.Biochem Pharmacol, 2003，65: 173–179.

［3］ Hosokawa M, Kudo M, Maeda H, et al. Fucoxanthin induces apoptosis and enhances the antiproliferative effect of the PPARγligand，troglitazone，on colon cancer cells［J］. Biochim Biophys Acta，2004，1675: 113–119.

［4］ Das S K, Hashimoto T, Shimizu K, et al. Fucoxanthin induces cell cycle arrest at G0／G1 phase in human colon carcinoma cells through up—regulation of p21WAF1／Cip1［J］. Biochim Biophys Acta，2005，1 762: 328–335.

［5］ Kil N K, Soo J H, Sung M K, et al. Fucoxanthin induces apoptosis in human leukemia HL–60 cells through a ROS-mediated Bcl–xL pathway［J］. Toxicology in Vitro, 2010，24: 1 648–1 654.

［6］ GB／T 15000.3–2008 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品 定值的一般原則和統(tǒng)計方法［S］.

［7］ 陳暉，方華，張怡評，等.海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制［J］.化學(xué)分析計量，2015，24(1): 1–4.

［8］ Soo J H，Seok C K，Sung M K. Cytoprotective effect of fucoxanthin isolated from brown algae Sargassum siliquastrum against H2O2–induced cell damage ［J］. Eur Food Res Technol，2008，228: 145–151.

［9］ Jarle A H，Gerhard E，Ernst G，et al. Algal carotenoids 48 structural assignments of geometrical isomers of fucoxanthin ［J］. Acta Chemica Scandinavica, 1992, 46: 389–395.

［10］ 尹尚軍，徐濤，劉麗平，等.羊棲菜巖藻黃質(zhì)的提取工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(4): 272–275.

［11］ 肖策.海帶中巖藻黃質(zhì)、巖藻甾醇、甘露醇和褐藻糖膠的綜合提取純化工藝研究［D］.西安：西北大學(xué)，2008.