姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

袁琦++++++張征++++++胡小宣

[摘要] 目的 研究姜黃素體外對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF表達(dá)的影響。方法 不同濃度（0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）姜黃素處理2013年8月—2014年2月中南大學(xué)提供的人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo24 h后，用Real-time PCR檢測(cè)姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF mRNA表達(dá)的變化，用Western blot法檢測(cè)姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果 人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞經(jīng)過(guò)姜黃素處理24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L姜黃素組VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 姜黃素能下調(diào)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF的表達(dá)，并呈劑量依賴(lài)，這可能是姜黃素抑制結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞增殖及侵襲性的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素；結(jié)腸癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）12（b）-0035-03

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取的一種天然有效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理作用，且毒性低，具有良好的臨床應(yīng)用潛力，尤其是其抗腫瘤作用受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，雖然近年來(lái)以手術(shù)、化療、放療、免疫等的綜合治療手段取得了一定的進(jìn)展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制著化療藥物和免疫制劑等的應(yīng)用和療效。有研究表明，姜黃素能顯著抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)[1]，姜黃素能顯著抑制人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[2]，研究證實(shí)在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）起到了極其重要的作用[3]。該實(shí)驗(yàn)以2013年8月—2014年2月中南大學(xué)提供的結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察了不同濃度姜黃素對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響，以求從多角度對(duì)姜黃素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用進(jìn)行研究，對(duì)結(jié)腸癌臨床治療提供有益的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞由中南大學(xué)腫瘤研究所提供；姜黃素購(gòu)自Sigma公司，稱(chēng)取3.684 mg的原料藥充分溶解于1 mL DMSO中，得到終濃度為10 mmol/L的母液，臨用時(shí)用完全細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司， 引物由大連寶生物公司合成。蛋白提取液及ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce公司， 兔抗人VEGF多克隆抗體及羊抗兔二抗lgG購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理

人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞接種于含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lovo細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組（姜黃素0 μmol/L，加入等量DMSO），姜黃素5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L組，處理后再置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 Real-time PCR

采用Trizo1試劑一步法提取細(xì)胞總RNA ，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，計(jì)算OD260/ 280，比值在1.8～2.0的RNA標(biāo)本用于反轉(zhuǎn)錄?？俁NA按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA， 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA用于Real-time-PCR擴(kuò)增。VEGF引物：5'端：5'-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3'及3'端：5'-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3'，變性、退火溫度為94℃與72℃，40個(gè)循環(huán)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品CT值計(jì)算出樣品中所含的模板量。

1.4 Western Blot

用蛋白提取液提取細(xì)胞蛋白， BCA測(cè)總蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，上樣量為20 μg。5%脫脂奶粉TBS緩沖液封閉，4℃過(guò)夜，加兔抗人VEGF多克隆抗體（ 1：500）室溫2 h， 洗膜30 min， 加入羊抗兔二抗（ 1：1000）室溫結(jié)合1 h， ECL顯色， 內(nèi)參采用β-actin。采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。以VEGF條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度比值代表VEGF蛋白的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示， 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響

利用Primer 3.0軟件分別設(shè)計(jì)出擴(kuò)增人VEGF和GAPDH mRNA的引物， Real-time PCR檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)，見(jiàn)表1，并用EXCEL做出各組VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖表達(dá)，見(jiàn)圖1，姜黃素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組與對(duì)照組相比，VEGF mRNA的表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且呈劑量依賴(lài)性。

表1 姜黃素處理后，Lovo細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)（x±s）

2.2 不同劑量姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

不同劑量姜黃素處理Lovo細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白，用Western Blot檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)（結(jié)果見(jiàn)圖2），并用Image-Pro Plus6.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析（結(jié)果見(jiàn)表1，圖3），姜黃素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組與對(duì)照組相比VEGF蛋白表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且呈劑量依賴(lài)性。endprint

3 討論

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF隨著腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移而表達(dá)明顯升高[4]。VEGF信號(hào)還與腫瘤細(xì)胞的淋巴管、淋巴結(jié)侵襲及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。梁?jiǎn)⒘妊芯堪l(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)水平與大腸癌組織學(xué)分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。且臨床觀察發(fā)現(xiàn)大腸癌患者術(shù)前血清VEGF水平與大腸癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。有研究者利用同源重組將結(jié)腸腸癌細(xì)胞系中VEGF-A敲除后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞缺失了VEGF信號(hào)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，且細(xì)胞對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性增強(qiáng)[8]，而在臨床上僅僅通過(guò)阻斷細(xì)胞表面的VEGF受體來(lái)治療結(jié)直腸癌效果是有限的。

目前研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠?qū)ο的[瘤有很好的抑制作用，其藥理活性主要表現(xiàn)在能夠下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-k B）的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，抑制血管生成[9]。在人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，姜黃素可有效抑制結(jié)腸腺癌細(xì)胞集落生長(zhǎng)和侵襲能力[10]。不同濃度姜黃素作用人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞24 h，增殖抑制顯著[11]。

該研究用4種不同濃度的姜黃素分別作用Lovo細(xì)胞24 h后，利用Real-time PCR及Western Blot方法檢測(cè)VEGF的mRNA及蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)各姜黃素組（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）與對(duì)照組比較，VEGF的mRNA及蛋白的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且姜黃素的作用濃度越高，VEGF的表達(dá)量越低，該作用呈劑量依賴(lài)，提示姜黃素能通過(guò)抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo中VEGF的表達(dá)來(lái)抗結(jié)腸癌血管形成，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此結(jié)果與賈佳等的觀點(diǎn)一致，他們發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中β-catenin、VEGF的表達(dá)[12]。在多個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中，均有研究證實(shí)姜黃素能下調(diào)VEGF的表達(dá)，進(jìn)一步可利用建立的結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型，從體內(nèi)水平研究姜黃素能否下調(diào)瘤組織VEGF的表達(dá)，且姜黃素是否通過(guò)NF-KB信通路來(lái)下調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)，該機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。VEGF是抗癌藥物治療的新靶點(diǎn)，姜黃素作用后的人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF水平下降，提示姜黃素可能通過(guò)下調(diào)VEGF的表達(dá)抑制了VEGF促進(jìn)腫瘤新生血管的作用，從而抑制了結(jié)腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移。該研究為姜黃素的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2014-09-16）endprint