豬鏈球菌毒力因子致病機(jī)制研究進(jìn)展

吳靜波，南文金，胡鴻惠

（1.韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東韶關(guān)512005；2.韶關(guān)學(xué)院英東動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室，廣東韶關(guān)512005）

豬鏈球菌（Streptococcussuis，SS）是給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的主要病原之一，也是一種人獸共患病病原，它能夠引發(fā)多種疾病，包括菌血癥、敗血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等，嚴(yán)重時(shí)可致休克性死亡。根據(jù)莢膜抗原的差異將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型（1-34，1／2），其中 SS1、SS2、SS1／2、SS7、SS9、SS14是主要的致病菌株，另外SS4、SS5、SS16和SS24也出現(xiàn)過人感染的病例［1］。目前歐洲、美洲、亞洲、澳大利亞和新西蘭均有人感染病例的報(bào)道，在大部分地區(qū)感染者一般為職業(yè)暴露人群，但在東亞和東南亞，SS也能感染一般人群，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全；在越南、泰國和香港，SS感染是成人腦膜炎的主要病因。而在中國，1998年和2005年則分別暴發(fā)了兩次致命的人群感染SS事件，造成240多人感染和52人死亡［2］。

SS感染后一般定植于機(jī)體黏膜上皮細(xì)胞，部分菌株不引起臨床癥狀，或者只導(dǎo)致輕微的菌血癥或敗血癥，但另外一些毒株可突破上皮屏障進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，侵入腦、心、肺等主要器官中，引發(fā)大量的炎癥反應(yīng)。出現(xiàn)這種毒力差異是因?yàn)椴煌愋秃筒煌貐^(qū)的SS菌株攜帶有不同的毒力因子［3］。毒力因子一直是SS研究的熱點(diǎn)，近年來，研究者應(yīng)用基因操作技術(shù)對(duì)SS的毒力因子進(jìn)行篩選，分析了近60個(gè)菌株，推測(cè)出約61個(gè)毒力相關(guān)因子。并根據(jù)各自特征及功能，將毒力因子分為4組，分別為表面／分泌因子類、酶／蛋白酶類、轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)因子、其他［1］。研究指出這些毒力因子均直接或間接影響菌株的致病性，但各毒力因子對(duì)菌株毒力的影響及對(duì)機(jī)體的具體作用機(jī)制仍不明確，嚴(yán)重阻礙了SS致病機(jī)制的研究［1］?，F(xiàn)階段研究主要限于細(xì)菌引發(fā)腦膜炎的機(jī)制，具體的致病機(jī)制仍不清楚，更是缺少細(xì)菌毒力因子與致病機(jī)制相關(guān)性的研究。本文主要簡述目前有關(guān)SS感染發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展，并重點(diǎn)介紹各個(gè)階段中相關(guān)毒力因子所起的作用，初步闡明毒力因子與發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。

1 SS定植過程

定植是SS感染的第一步，而黏附和入侵黏膜上皮細(xì)胞則是SS成功定植的先決條件。在動(dòng)物中，SS能夠在扁桃體中長久生存的具體機(jī)制仍不清楚，但扁桃體中的淋巴組織被黏膜上皮覆蓋，隔斷了細(xì)菌和免疫系統(tǒng)之間的直接接觸，為SS的長久定植提供了一個(gè)較為穩(wěn)定的環(huán)境；這一優(yōu)勢(shì)在豬體上更為明顯，豬的黏膜上皮細(xì)胞深嵌入淋巴結(jié)組織中，形成眾多的分支隱窩，極大的增加了細(xì)菌的接觸面積，更有利于SS黏附和入侵黏膜上皮細(xì)胞［4］。

1.1 黏附過程

SS黏附過程一般是菌體表面蛋白分子與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互反應(yīng)的過程，ECM包括纖粘連蛋白、纖維蛋白溶酶原和膠原等。大部分菌體表面或分泌型的毒力因子均參與了細(xì)菌的黏附，包括纖粘連蛋白結(jié)合蛋白（Fbps）、烯醇酶（Eno）、雙肽酰肽酶IV（Dpp IV）、分選酶 A（SrtA）、溶菌酶釋放蛋白（MRP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、熱休克蛋白J（DnaJ）、表面黏附素（Ssa）等，其中Fbps、Eno、Dpp IV、GAPDH、DnaJ、Ssa都可直接與 ECM 反應(yīng)，起毒力因子作用；而MRP需要經(jīng)SrtA加工后錨定于細(xì)胞壁肽聚糖上后才能與ECM結(jié)合［4-7］。研究顯示除Fbps外上述毒力因子的缺失株均能明顯降低SS的黏附能力，但不能完全阻斷細(xì)菌黏附，即SS黏附是由細(xì)胞壁上多個(gè)組成共同參與的，缺少其中一個(gè)或多個(gè)都不能完全阻斷細(xì)菌黏附［4，6，7］。另外，毒力因子莢膜蛋白（CPS）阻礙了表面蛋白與ECM的結(jié)合，是SS黏附作用的負(fù)調(diào)節(jié)子，抑制其黏附和侵入上皮細(xì)胞，但也有研究顯示CPS中的多種成分有助于細(xì)菌黏附，尤其是其中的唾液酸成分［5］。

1.2 入侵過程

入侵黏膜上皮細(xì)胞不是SS成功定植的必要條件，但有利于細(xì)菌生存，并且可能是SS在體內(nèi)擴(kuò)撒和發(fā)病的首要步驟。毒力因子溶血素（Sly）是一種膽固醇結(jié)合類細(xì)胞毒素，在SS侵入和裂解細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用，可破壞微血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，有利于細(xì)菌在組織內(nèi)擴(kuò)散［5，8，9］。不過并非所有SS都含有Sly基因，其流行存在一定地域性，北美分離株的溶血素陽性率明顯低于歐洲、亞洲分離株；另外部分Sly基因敲除菌株也能出現(xiàn)在血液中，并且毒力與親本株相似［5］。因此，不能單純以Sly作為區(qū)別豬鏈球菌毒力強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)。

SIgA介導(dǎo)的黏膜免疫系統(tǒng)在抵御SS入侵中扮演著重要角色，而毒力因子IgA蛋白酶（Iga1protease）能夠減少免疫效應(yīng)IgA的含量，降低機(jī)體的防御能力；降解釋放的Fab片段還能提高菌體表面疏水性，以增強(qiáng)細(xì)菌的黏附能力并阻止完整IgA接觸菌體［4］。研究顯示Iga1protease缺失后，缺失株抵抗吞噬細(xì)胞的能力和對(duì)Hep-2細(xì)胞的黏附能力明顯下降；豬的攻毒試驗(yàn)顯示親本株和缺失株的致病率分別為100%和22%，存在差異，同時(shí)缺失株組血液中的帶菌量和致死率也明顯下降，表明Iga1protease與SS的黏附和侵入密切相關(guān)［10］。

2 SS傳播過程

SS必須突破黏膜上皮細(xì)胞才能進(jìn)入血液或組織中引發(fā)疾病，目前SS突破的位置仍不明確，比較認(rèn)可的位置是上呼吸道內(nèi)的黏膜上皮細(xì)胞［1］。SS突破黏膜上皮細(xì)胞到達(dá)深層組織或血液中，就有被巨噬細(xì)胞吞噬的可能。但在缺乏特異性抗體的條件下，SS可抵御巨噬細(xì)胞的吞噬，導(dǎo)致血液中菌體濃度不斷升高，引起菌血癥和炎癥反應(yīng)。SS抵御巨噬細(xì)胞吞噬主要依靠CPS；研究顯示CPS能夠使SS免受中性粒細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷［11］。進(jìn)一步研究顯示CPS的這種抗吞噬作用主要依靠其豐富的唾液酸（SA）成分，SA是許多細(xì)菌的抗吞噬因子，能夠黏附于巨噬細(xì)胞上，弱化巨噬細(xì)胞吞噬作用［12-13］。

當(dāng)然SS的抗吞噬作用不單靠CPS，研究顯示毒力因子肽聚糖葡糖胺脫乙酰酶（PgdA）也有助于SS抵抗吞噬細(xì)胞吞噬；敲除PgdA后，抵抗中性粒細(xì)胞吞噬的能力明顯下降，攻毒試驗(yàn)也顯示缺失株的毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于親本株。進(jìn)一步研究顯示SS與中性粒細(xì)胞相互作用后能夠上調(diào)PgdA的表達(dá)，促進(jìn)肽聚糖的脫乙?；?，以抵御中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用。相似的毒力作用還表現(xiàn)在毒力因子磷壁酸D-丙氨?；福―ltA）上［14］。

另外，SS在傳播的過程中需要攝取宿主體內(nèi)的微量元素，以維持細(xì)菌的正常生長代謝［15］。SS的微量元素吸收調(diào)控蛋白（AdcR，PerR，mtsR）［16-18］、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Fhu，F(xiàn)eoB，Mut，Mts）［18］和結(jié)合脂蛋白（TroA）［19］等組成的金屬微量元素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，保證了細(xì)菌在擴(kuò)散過程中獲得生長必須的營養(yǎng)成分，對(duì)SS持續(xù)感染有著至關(guān)重要的作用，缺失任何一個(gè)都能造成血液中菌體濃度的下降。不過這些毒力因子是否與SS的致病機(jī)制有關(guān)，仍需要進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

3 炎癥反應(yīng)和感染性休克過程

SS感染后能夠激活機(jī)體免疫系統(tǒng)以抵御細(xì)菌感染，但是過度的免疫應(yīng)答卻能引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，甚至是感染性休克。研究發(fā)現(xiàn)部分SS感染宿主能誘導(dǎo)過量促炎癥因子的釋放，包括TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-γ和趨化因子CCL2／MCP-1、CCL3、CCL5／RANTES、CXCL1／KC、CXCL8等，激活NF-кB通路，破壞機(jī)體免疫平衡狀態(tài)，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)［20-24］。推測(cè)這可能是SS感染早期引起宿主急性死亡的原因，另外大量促炎癥因子的產(chǎn)生能夠增加血腦屏障的通透性，幫助SS進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)腦膜炎［22］。

大量試驗(yàn)表明，SS的細(xì)胞壁成分在誘導(dǎo)促炎癥因子釋放的過程中發(fā)揮著重要作用；Tanabe S等［20］發(fā)現(xiàn)全細(xì)胞壁成分在體外刺激人巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)大量IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的產(chǎn)生，并且人血紅素能夠明顯增強(qiáng)該誘導(dǎo)作用。對(duì)細(xì)胞壁成分的進(jìn)一步研究顯示，CPS能夠與宿主TLR-2作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8，并特異性誘導(dǎo)趨化因子MCP-1和CCL3的產(chǎn)生［20-23］；脂蛋白（Lgt）與 TLR-2／6復(fù)合體作用能夠誘導(dǎo)IL-1β、IL-8的產(chǎn)生，并激活轉(zhuǎn)錄因子 NF-кB［24］；Sly與 TLR-4結(jié)合能夠激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)TNF-α和IL-6的釋放，并激活轉(zhuǎn)錄因子 NF-кB［8］；枯草桿菌素樣蛋白酶（SspA）能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL8和 CCL5［26］。

4 突破血腦屏障過程

動(dòng)物試驗(yàn)顯示，宿主感染SS后早期主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎，跛行，蜷伏等，然后發(fā)展為敗血癥性休克，如果感染宿主沒有因敗血癥和中毒性休克死亡，細(xì)菌則容易進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）引起腦膜炎［22］，大約69.5%的病人可發(fā)展為腦膜炎［2］。與其他血源性病原相似，SS要成功侵入CNS必須經(jīng)過血腦屏障（BBB）。構(gòu)成BBB的主要細(xì)胞為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC），體外試驗(yàn)表明單純的SS能夠黏附于BMEC上但不能直接侵入BMEC；在這之前研究者推測(cè)SS突破BBB可能存在以下兩種機(jī)理。一是“特洛伊木馬”理論［5］，SS黏附于巨噬細(xì)胞上，或者被吞噬細(xì)胞吞噬，在巨噬細(xì)胞突破血腦屏障后釋放細(xì)菌；二是跨細(xì)胞途徑，SS誘導(dǎo)BMEC產(chǎn)生IL-6、IL-8和MCP-1等促炎癥因子，能夠使細(xì)胞的通透性增加，甚至破裂；有助于細(xì)菌侵入細(xì)胞穿過屏障［22］。所以，與細(xì)胞黏附和促炎癥因子釋放有關(guān)的毒力因子都與SS突破血腦屏障過程緊密相關(guān)。

不過，最近有研究者提出第3個(gè)突破途徑，即細(xì)胞旁路途徑，認(rèn)為SS通過BMEC之間的細(xì)胞間隙穿過BBB。BBB的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是細(xì)胞間的緊密連接，緊密連接由Claudin、Occludin和連接黏附分子JAM組成，在維持細(xì)胞極性、細(xì)胞通透性及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性方面起重要作用。而研究顯示SS的細(xì)胞壁成分SSU05-1000蛋白和SSU05-0272蛋白分別與BMEC作用后均能夠引起Claudin-5表達(dá)量下降，破壞細(xì)胞間的緊密連接，導(dǎo)致通透性升高，從而有助于SS通過細(xì)胞旁路途徑進(jìn)入CNS［26-27］。

5 結(jié)語

不可否認(rèn)，毒力因子與細(xì)菌的致病機(jī)制息息相關(guān)。但目前對(duì)豬鏈球菌毒力的定義還比較模糊，大部分研究者將從患病宿主中分離的菌株定義為有毒力株，從健康宿主分離的菌株定義為無毒力株，缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。不同的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)毒力的觀念、研究方向和方法都存在差異，并且使用菌株和試驗(yàn)動(dòng)物也存在差別。這就造成了部分毒力因子只針對(duì)于特定的菌株或動(dòng)物中，或者同一毒力因子在不同菌株或動(dòng)物中致病力不同；另外利用基因敲除和突變技術(shù)進(jìn)行研究，可能只是影響SS的生長代謝而造成毒力降低或消失的假象［28］，由此鑒定出的基因元件可能并不是SS的毒力因子或者與SS致病機(jī)制無關(guān)。所以雖然近年來研究推測(cè)出的毒力因子很多，但能明確的毒力相關(guān)因子卻寥寥無幾，并且目前并沒有發(fā)現(xiàn)可明確區(qū)分強(qiáng)毒株，弱毒株，無毒株的標(biāo)志性毒力因子，毒力的確定困難重重，極大影響了SS致病機(jī)制的研究。本文對(duì)SS感染宿主和致病的每一個(gè)階段都進(jìn)行了全面的論述，深入分析了各個(gè)階段中相關(guān)毒力因子所發(fā)揮的作用，將SS的毒力因子與其致病機(jī)制相結(jié)合進(jìn)行探討，闡明了毒力因子與致病機(jī)制之間緊密的相關(guān)性，為深入研究SS的具體致病機(jī)制提供參考。

［1］Feng Y J，Zhang H M，Wu Z W，et al.Streptococcussuisinfection：an emerging／reemerging challenge of bacterial infectious diseases？［J］.Virulence，2014，5（4）：477-497.

［2］Huong V T，Ha N，Huy N T，et al.Epidemiology，clinical manifestations，and outcomes ofStreptococcussuisinfection in humans［J］.Emerg Infect Dis，2014，20（7）：1105-1114.

［3］Fulde M，Valentin-Weigand P.Epidemiology and pathogenicity of zoonotic streptococci［J］.Curr Top Microbiol Immunol.2013，368：49-81.

［4］Fittipaldi N，Segura M，Grenier D，et al.Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agentStreptococcussuis［J］.Future Microbiol，2012，7（2）：259-279.

［5］Baums C G，Valentin-Weigand P.Surface-associated and secreted factors ofStreptococcussuisin epidemiology，pathogenesis and vaccine development［J］.Anim Health Res Rev，2009，10（1）：65-83.

［6］Zhang X Y，Jiang X W，Yang L，et al.DnaJ ofStreptococcussuistype 2contributes to cell adhesion and thermotolerance［J］.J Microbiol Biotechnol，2015，25（6）：771-781.

［7］Li W，Wan Y，Tao Z，et al.A novel fibronectin-binding protein ofStreptococcussuisserotype 2contributes to epithelial cell invasion andinvivodissemination［J］.Vet Microbiol，2013，162（1）：186-194.

［8］He Z G，Pian Y Y，Ren Z Q，et al.Increased production of suilysin contributes to invasive infection of theStreptococcussuisstrain 05ZYH33［J］.Mol Med Rep，2014，10（6）：2819-2826.

［9］Seitz M，Baums C G，Neis C，et al.Subcytolytic effects of suilysin on interaction ofStreptococcussuiswith epithelial cells［J］.Vet Microbiol，2013，167（3-4）：584-591.

［10］Zhang A D，Mu X F，Chen B，et al.IgA1protease contributes to the virulence ofStreptococcussuis［J］.Vet Microbiol，2011，148（2-4）：436-439.

［11］Zhao J Q，Pan S，Lin L，et al.Streptococcussuisserotype 2 strains can induce the formation of neutrophil extracellular traps（NETs）and evade trapping［J］.FEMS Microbiol Lett，2015，362（6）.http：／／dx.doi.org／10.1093／femsle／fnv022.

［12］Feng Y J，Cao M，Shi J，et al.Attenuation ofStreptococcussuisvirulence by the alteration of bacterial surface architecture［J］.Sci Rep，2012（2）：710.

［13］Lecours M P，F(xiàn)ittipaldi N，Takamatsu D，et al.Sialylation ofStreptococcussuisserotype 2is essential for capsule expression but is not responsible for the main capsular epitope［J］.Microbes Infect，2012，14（11）：941-950.

［14］吳立志，王金良，肖躍強(qiáng)，等.豬鏈球菌2型毒力因子研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（6）：118-122.

［15］Wu C，Labrie J，Tremblay Y D，et al.Zinc as an agent for the prevention of biofilm formation by pathogenic bacteria［J］.J Appl Microbiol，2013，115（1）：30-40.

［16］Aranda J，Garrido M E，F(xiàn)ittipaldi N，et al.The cation-uptake regulators AdcR and Fur are necessary for fullvirulence ofStreptococcussuis［J］.Vet Microbiol，2010，144（1-2）：246-249.

［17］Zhang T F，Ding Y，Li T T，et al.A Fur-like protein PerR regulates two oxidative stress response related operons dpr and metQIN inStreptococcussuis［EB／OL］.BMC Microbiol，2012，12：85.http：／／www.biomedcentral.com／1471-2180／12／85.

［18］黎 明，馬 超，李學(xué)如，等.豬鏈球菌鐵元素吸收及其機(jī)理研究進(jìn)展［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2014，30（1）：89-92.

［19］Wichgers Schreur P J，Rebel J M J，Smits M A，et al.TroA ofStreptococcussuisis required for manganese acquisition and full virulence［J］.J Bacteriol，2011，193（19）：5073-5080.

［20］Tanabe S，Gottschalk M，Grenier D.Hemoglobin andStreptococcussuiscell wallact in synergy to potentiate the inflammatory response of monocyte-derived macrophages［J］.Innate Immun，2008，14（6）：357-363.

［21］朱 靜，胡 丹，劉麗娜，等.莢膜唾液酸對(duì)豬鏈球菌激活巨噬細(xì)胞TLR2-AKT-NF-κB信號(hào)通路影響的研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（6）：1058-1047.

［22］Bi Y H，Li J，Yang L M，et al.Assessment of the pathogenesis ofStreptococcussuistype 2infection in piglets for understanding streptococcal toxic shock-like syndrome，meningitis，and sequelae［J］.Vet Microbiol，2014，173（3-4）：299-309.

［23］Calzas C，Goyette-Desjardins G，Lemire P，et al.Group B Streptococcus andStreptococcussuiscapsular polysaccharides induce chemokine production by dendritic cells via Toll-like receptor 2-and MyD88-dependent and-independent pathways［J］.Infect Immun，2013，81（9）：3106-3118.

［24］Wichgers Schreur P J，Rebel J M J，Smits M A，et al.Lgt processing is an essential step inStreptococcussuislipoprotein mediated innate immune activation［J］.PLoS One，2011，6（7）：e22299.

［25］Bonifait L，Grenier D.The SspA subtilisin-like protease ofStreptococcussuistriggers a pro-inflammatory response in macrophages through a non-proteolytic mechanism［EB／OL］.BMC Microbiol，2011，11：47.http：／／www.biomedcentral.com／1471-2180／11／47.

［26］王 濤，鄭玉玲，袁 媛，等.豬鏈球菌細(xì)胞壁蛋白SSU05-1000的表達(dá)、純化及活性分析［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2013，29（8）：757-761.

［27］陳 哲，鄭玉林，郝淮杰，等.豬鏈球菌胞壁蛋白SSU05-0272對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin的調(diào)控［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28（5）：500-502.

［28］馬建華，魏建忠.豬鏈球菌毒力因子研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（8）：95-99.