基于特征圖譜及指標(biāo)成分優(yōu)化新清毒飲顆粒的制備工藝

陸小夢，古玉正，劉瑞媚，林銀慧，周珊宇，何欣欣，肖飛，張軍，黃新安（. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心，廣東廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司，廣東廣州 50445；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 50006）

新清毒飲由國醫(yī)大師鄧鐵濤師承團(tuán)隊(duì)治療病毒性感冒的臨床經(jīng)驗(yàn)方[1]加減而來，由蒲公英、金銀花、野菊花等17味中藥組成，具有清熱解毒、解表化濕、止咳平喘之功效，方中金銀花、蒲公英等多味藥材對流感病毒有良好的抑制活性，臨床上用于由流感病毒等引起的上呼吸道感染等疾病[2-5]。為了方便臨床使用，同時(shí)保證湯劑療效，將其開發(fā)成顆粒劑。依據(jù)《中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[6]，中藥復(fù)方制劑應(yīng)建立其特征圖譜并制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，并以相似度、相對峰面積等為檢測指標(biāo)控制其質(zhì)量。中藥特征圖譜現(xiàn)已廣泛用于中藥提取工藝環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制、藥材和制劑的整體評價(jià)[7-8]，但未見將特征圖譜與指標(biāo)成分保留率相結(jié)合考察復(fù)方制劑制備工藝的研究。蒲公英為處方中的君藥，其主要成分菊苣酸具有抗病毒、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[9-11]。2020 年版《中國藥典》增加了蒲公英中菊苣酸的含量測定。處方中甘草的主要成分甘草酸具有抗病毒、抗炎、抗過敏等作用[12-14]。中藥復(fù)方制備過程中有效成分保留率易受煎煮溫度、溶劑、料液比等的影響[15-17]；在中試或大生產(chǎn)中，不穩(wěn)定藥效成分如金銀花、蒲公英中綠原酸、菊苣酸等酚酸類成分經(jīng)過相對長時(shí)間的提取、濃縮、干燥，保留率或有降低[18-20]。本研究擬建立新清毒飲的特征圖譜與蒲公英中菊苣酸、甘草中甘草酸的含量測定方法，以追蹤各工藝步驟中有效成分的保留情況，優(yōu)化其制備工藝，并開展中試生產(chǎn)驗(yàn)證優(yōu)選的工藝路線，關(guān)注并克服規(guī)模生產(chǎn)下不穩(wěn)定藥效成分的降解，制備與原方湯劑物質(zhì)基礎(chǔ)近似的顆粒劑，以期重現(xiàn)新清毒飲湯劑臨床療效。

1 儀器與材料

SECVRA225D-1CN 十萬分之一電子天平、BSA224S-CW 萬分之一電子天平（德國賽多利斯有限公司）；LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；ZORBAX-SB-Phenyl色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫公司）；Symmertry?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Waters 公司）；KQ-250DE 超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；R205B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物科技有限公司）；3000 L 多功能提取罐、1000 L 減壓濃縮機(jī)組（江蘇沙家浜化工設(shè)備有限公司）；PS1000-NC 高速離心機(jī)（遼陽中聯(lián)制藥機(jī)械有限公司）；ZKS-5型真空上料機(jī)（江陰市宏達(dá)分體設(shè)備有限公司）；FZ200沸騰制粒機(jī)（浙江迦南科技股份有限公司）；DXDK-80C 顆粒全自動(dòng)包裝機(jī)（珠海市天楹精密機(jī)械有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

對照品菊苣酸（批號：111752-202105，純度98.3%）、綠原酸（批號：110753-202119，純度96.3%）、蘆丁（批號：100080-202012，純度92.2%）、甘草苷（批號：111610-201908，純度95%）、木犀草苷（批號：111720-202111，純度96.6%）、蒙花苷（批號：111528-201911，純度98.5%）、補(bǔ)骨脂素（批號：110739-201918，純度99.6%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，純度96.2%），中國食品藥品檢定研究院。處方飲片來源信息見表1。

表1 新清毒飲藥材來源信息Table 1 Source informations of Xinqingduyin

2 方法與結(jié)果

2.1 特征圖譜測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（見表2）；檢測波長：240 nm；流速：0.9 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表2 特征圖譜測定的流動(dòng)相洗脫梯度Table 2 Elution gradient of mobile phase used in HPLC characteristic spectra

2.1.2 混合對照品溶液的配制 取對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含菊苣酸、綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、補(bǔ)骨脂素、甘草酸分別為73.436、394.400、7.328、0.912、1.602、0.966、6.135、8.070 μg的混合對照品溶液。

2.1.3 新清毒飲顆粒及陰性顆粒的制備 按處方比例稱取17 味藥材飲片，加8 倍量水煎煮3 次，每次1 h，煎煮3 次，過濾，合并濾液；取濾液80 ℃減壓濃縮成浸膏（含飲片生藥量2 g·g-1）；取浸膏70 ℃干燥并粉碎成浸膏粉，以適量乳糖作輔料，制粒，即可得新清毒飲顆粒。按處方比例分別稱取缺單味藥材的飲片，同法制備新清毒飲陰性顆粒。

2.1.4 新清毒飲單味藥材配方顆粒的制備 取單味藥材的飲片50 g，同“2.1.3”項(xiàng)制備成單味藥材配方顆粒。

2.1.5 供試品、陰性對照、單味藥材樣品溶液的配制取新清毒飲顆粒1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放至室溫。再稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得新清毒飲供試品。另取陰性顆粒、單味藥材配方顆粒各1.0 g，同法制備陰性對照液、單味藥材對照液。

2.1.6 特征圖譜專屬性試驗(yàn)與指認(rèn) 取“2.1.2”“2.1.5”項(xiàng)下各溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣檢測，考察實(shí)驗(yàn)方法的適用性及專屬性。特征圖譜見圖1。樣品中各峰分離良好，峰形對稱。通過陰性對照液、單味藥材溶液與供試品溶液色譜比較，對色譜峰進(jìn)行歸屬和定位，共標(biāo)定16個(gè)峰。1號峰歸屬于白花蛇舌草，6、10 號峰歸屬于金銀花，8、16 號峰歸屬于甘草，12號峰歸屬蒲公英，14號峰歸屬野菊花、桑葉，15號峰歸屬五指毛桃，2、3、4、5、7、9、11、13號色譜峰分別歸屬于多個(gè)藥味共有峰。通過對照品對照，鑒別了5號峰為綠原酸，7號峰為蘆丁，8、16號峰為甘草苷和甘草酸，9號峰為木犀草苷，12號峰為菊苣酸，14號峰為蒙花苷，15號峰為補(bǔ)骨脂素。

圖1 新清毒飲顆粒高效液相色譜（HPLC）特征圖譜Figure 1 HPLC fingerprint of Xinqingduyin Granules

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜峰，以5 號峰（綠原酸）為參照峰（S），計(jì)算各峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，1～16 號峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 分別為0.01%～1.01%和0.15%～1.22%，表明儀器的精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、3、6、12、18、24、36 h 進(jìn)樣測定，結(jié)果表明1～16 號峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 分別為0.01%～1.11%和0.12%～1.54%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取新清毒飲顆粒6 份，按“2.1.5”項(xiàng)制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，以5號峰（綠原酸）為參照峰，結(jié)果顯示1～16號峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 分別為0.01%～0.18%和0.29%～3.21%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2 含量測定方法

2.2.1 色譜條件 （1）菊苣酸：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表3）；流速：0.9 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：327 nm；理論塔板數(shù)按菊苣酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表3 菊苣酸含量測定的流動(dòng)相洗脫梯度Table 3 Elution gradient of mobile phase in the content determination of chicory acid

（2）甘草酸：色譜柱為Symmetry?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表4）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：31 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：252 nm；理論塔板數(shù)按甘草酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表4 甘草酸含量測定的流動(dòng)相洗脫梯度Table 4 Elution gradient of mobile phase in the content determination of glycyrrhizic acid

2.2.2 對照品溶液的制備 取菊苣酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為151.480 3 μg·mL-1的菊苣酸對照品溶液。同法制成濃度為471.441 2 μg·mL-1的甘草酸對照品溶液。

2.2.3 供試品及陰性對照溶液制備 新清毒飲顆粒供試品溶液、缺蒲公英陰性對照液和缺甘草陰性對照液制備方法同“2.1.3”項(xiàng)下。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下各個(gè)溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，菊苣酸峰、甘草酸峰分離度良好，陰性無干擾。見圖2。

圖2 新清毒飲顆粒的高效液相色譜圖Figure 2 HPLC chromatography of Xinqingduyin Granules

2.2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下菊苣酸對照品溶液，加甲醇稀釋配制75.740 2、30.296 1、15.148 0、12.118 4、6.059 2、3.029 6 μg·mL-1的系列對照品濃度。同法，取甘草酸對照品溶液配制成188.576 5、94.288 2、37.715 3、18.857 6、9.428 8、4.714 4 μg·mL-1，依法進(jìn)樣測定，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。菊苣酸線性方程為：Y=52 686.18X-28 106.94，r=1.000 0，表明菊苣酸在3.029 6～151.480 3 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。甘草酸線性方程為：Y=8 026.63X+509.10，r=0.999 8，表明甘草酸在4.714 4～471.441 2 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一份菊苣酸、甘草酸對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)重復(fù)進(jìn)樣6 次測定，結(jié)果菊苣酸、甘草酸的峰面積的RSD 分別為0.92%、0.23%，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下同一份供試品溶液，分別于0、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，結(jié)果菊苣酸的峰面積均值為477 754，RSD 為0.51%，甘草酸峰面積均值為120 273，RSD 為0.22%。結(jié)果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批新清毒飲顆粒6 份，按“2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，依“2.2.1”項(xiàng)下方法測定。測得菊苣酸平均含量為0.246 1 mg·g-1，RSD 為0.92%，甘草酸平均含量為0.758 1 mg·g-1，RSD 為0.48%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收測定 取已知含量的新清毒飲顆粒0.5 g，各6份，精密稱定，分別加入與顆粒中菊苣酸含量、甘草酸含量相等的對照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品并進(jìn)樣測定，計(jì)算得菊苣酸、甘草酸回收率分別為99.77%、97.74%，RSD 分別為1.09%、2.79%。結(jié)果說明本方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3 工藝考察

2.3.1 提取工藝考察 按照臨床湯劑應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，本試驗(yàn)采用水煎煮法。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）作為影響因素，因素與水平見表5。按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，制備S1～S9 號試驗(yàn)溶液，取試驗(yàn)溶液依“2.1”“2.2”項(xiàng)下方法測定特征圖譜及指標(biāo)成分含量，計(jì)算保留率。

表5 新清毒飲顆粒的正交試驗(yàn)因素水平表Table 5 Design of factors and levels of orthogonal test for Xinqingduyin Granules

2.3.1.1 特征圖譜結(jié)果分析 結(jié)果見圖3。從S1～S9 號試驗(yàn)溶液圖譜可見，1～16 號特征峰均可保留，表明加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素改變對成分種類未造成影響；以1 號試驗(yàn)藥液（S1）中5 號峰（綠原酸）為參照峰，計(jì)算相對峰面積。結(jié)果見表6。各峰的相對峰面積RSD 較大，即對成分含量有影響，故應(yīng)以指標(biāo)成分的保留率結(jié)果優(yōu)化工藝參數(shù)。

圖3 新清毒飲顆粒的正交試驗(yàn)特征圖譜的疊加圖Figure 3 Superimposed characteristic chromatogram of orthogonal test for Xinqingduyin Granules

表6 新清毒飲顆粒的正交試驗(yàn)特征圖譜相對峰面積結(jié)果Table 6 Results of relative peak area of characteristic chromatograms in orthogonal experiment of Xinqingduyin Granules

2.3.1.2 以指標(biāo)成分保留率為指標(biāo)優(yōu)化工藝參數(shù) 設(shè)置菊苣酸保留率（X）、甘草酸保留率（Y）的權(quán)重系數(shù)分別為0.6、0.4，綜合評分（M）=（0.6X/菊苣酸最大的保留率+0.4Y/甘草酸最大的保留率）×100，對上述3個(gè)因素進(jìn)行考察，優(yōu)選較佳的提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果見表7，方差分析見表8。

表7 新清毒飲顆粒的正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 7 Orthogonal test and results of Xinqingduyin Granules

表8 新清毒飲顆粒的正交試驗(yàn)方差分析Table 8 Analysis of variance for orthogonal test of Xinqingduyin Granules

結(jié)果顯示，各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為：C＞A＞B，加水量（A）、提取時(shí)間（B）均無顯著性影響，提取次數(shù)（C）對試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。為節(jié)約成本，縮短生產(chǎn)周期，保證有效成分的保留率，結(jié)合方差分析結(jié)果，擬采取最佳提取工藝：A1B1C3，即加8倍量水，提取3次，每次1 h。

2.3.2 濃縮工藝考察

2.3.2.1 濃縮方式考察 以“2.3.1”項(xiàng)下確定的提取工藝制備新清毒飲提取液，作為濃縮工藝對照樣品。準(zhǔn)確量取2 500 mL提取液各2份，分別考察常壓、減壓濃縮成含飲片量2 g·g-1浸膏。取濃縮液，同“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定特征圖譜，以對照樣品的特征圖譜中5 號峰為S 峰，計(jì)算各峰相對峰面積；依次將樣品的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 年版）”軟件，以對照樣品色譜圖為參照，對樣品色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark 峰匹配，計(jì)算相似度。同時(shí)，按“2.2”項(xiàng)下方法測定甘草酸、菊苣酸含量，計(jì)算保留率。

從特征圖譜可見，兩種濃縮方式均能保留1～16 號特征峰（見圖4）；常壓、減壓濃縮特征圖譜的相似度結(jié)果分別為0.963、0.999，均大于0.9，說明兩種方式未對成分種類造成顯著性影響；相同生藥量下，6、7 號等特征峰的相對峰面積差異較大（見表9），表明不同濃縮方式對含量有一定影響，故以指標(biāo)成分保留率為指標(biāo)進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)。

圖4 新清毒飲顆粒不同濃縮方式的特征圖譜疊加圖Figure 4 Superimposed characteristic chromatograms of Xinqingduyin Granules with different concentrative methods

表9 新清毒飲顆粒不同濃縮方式特征圖譜的相對峰面積Table 9 The relative peak area of characteristic peaks of Xinqingduyin Granules with different concentrative methods

與對照樣品對比，減壓濃縮對試驗(yàn)結(jié)果的影響較?。ㄒ姳?0），且濃縮時(shí)間短，結(jié)合相似度結(jié)果，最終選擇減壓濃縮。

表10 新清毒飲顆粒不同濃縮方式指標(biāo)成分保留率結(jié)果Table 10 Results of retention rates of index components in Xinqingduyin Granules with different concentrative methods

2.3.2.2 濃縮溫度考察 按“濃縮方式”操作，準(zhǔn)確量取提取液2 500 mL，各2 份，考察不同濃縮溫度（60～90 ℃）對特征圖譜及指標(biāo)成分保留率的影響。

從特征圖譜可見，不同濃縮溫度均能保留1～16 號特征峰（見圖5）；濃縮溫度60～90 ℃特征圖譜的相似度結(jié)果均為0.999，說明不同濃縮溫度對成分種類未造成顯著性影響；不同濃縮溫度的特征圖譜中，1、6、7 號峰的相對峰面積差異略大，余峰差異不大（見表11），表明溫度對樣品的成分含量仍有一定的影響，故應(yīng)進(jìn)一步考察濃縮溫度對指標(biāo)成分保留率的影響。

圖5 新清毒飲顆粒的不同濃縮溫度的特征圖譜疊加圖Figure 5 Superimposed characteristic chromatograms of Xinqingduyin Granules under different concentrative temperatures

表11 新清毒飲顆粒不同濃縮溫度的特征圖譜相對峰面積Table 11 The relative peak area of characteristic chromatograms of Xinqingduyin Granules under different concentrative temperatures

由綜合評分結(jié)果可知，隨著濃縮溫度上升，綜合評分逐漸降低，但無顯著性差異（見表12）。為縮短生產(chǎn)周期，保證成分保留率，選擇80 ℃減壓濃縮作為最佳工藝。

表12 新清毒飲顆粒不同濃縮溫度的指標(biāo)成分保留率結(jié)果Table 12 Results of retention rates of index components in Xinqingduyin Granules under different concentrative temperatures

2.3.3 成型工藝考察 按優(yōu)選工藝，取“2.3.2”項(xiàng)下提取液，于80 ℃減壓濃縮成含飲片量2 g·g-1的浸膏樣品；稱取浸膏于70 ℃減壓干燥制成浸膏粉，備用。

2.3.3.1 輔料種類篩選 取浸膏粉48 g（相當(dāng)于181 g飲片量），各2份，分別與糊精、乳糖、可溶性淀粉、甘露醇4 種輔料1∶1 混勻，噴入75%乙醇適量，混勻，制成軟材，過篩，制成顆粒?？疾燔洸臓顟B(tài)、制粒難度、成型率、吸濕率等指標(biāo)以優(yōu)選輔料種類。

結(jié)果顯示，乳糖成型率最高且吸濕性最小，優(yōu)于可溶性淀粉，甘露醇制得顆粒質(zhì)地較硬，顏色不均勻，糊精所得顆?？诟胁睿ㄒ姳?3），故優(yōu)選乳糖為輔料。

表13 新清毒飲顆粒制粒輔料的篩選Table 13 Screening of excipients for granulation of Xinqingduyin Granules

2.3.3.2 輔料用量配比考察 取浸膏粉48 g，各2 份，分別與不同乳糖配比制成顆粒，以顆粒成型性、吸濕性、休止角等為指標(biāo)考察輔料用量。

結(jié)果顯示，當(dāng)浸膏粉與乳糖用量配比為1∶1.14或1.2∶1.5時(shí)，顆粒成型率高，休止角小，吸濕性?。ㄒ姳?4）。為減少服用量，故選擇浸膏粉∶乳糖的比例為1∶1.14。

表14 新清毒飲顆粒輔料用量的考察結(jié)果Table 14 Investigation result of excipient dosage of Xinqingduyin Granules

2.3.3.3 矯味劑考察 按上處方配比制成顆粒，經(jīng)口嘗具有一定苦澀味，故在相關(guān)研究[21-22]基礎(chǔ)上優(yōu)選甜菊素作為本品矯味劑，并通過不同用量的優(yōu)選考察，當(dāng)甜菊素用量為成品質(zhì)量的0.5%時(shí)，口感得到改善。故確定本品甜菊素用量為成品質(zhì)量的0.5%。

2.4 中試工藝及樣品測定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選的制備工藝，按處方稱取17 味中藥，共181 kg，共3 份，加8 倍量水，煎煮3 次，每次1 h，藥液濾過。合并濾液，80 ℃下減壓濃縮成浸膏（相對密度1.10～1.20，60～70 ℃），加入成品質(zhì)量0.5 %的甜菊糖苷溶液（濃度約為10 %，m/V），以適量乳糖（浸膏粉∶乳糖=1∶1.14）作輔料，一步制粒，分裝（每袋10 g），即得。中試工藝過程數(shù)據(jù)的相關(guān)結(jié)果見表15。依法測定中試提取液、浸膏、顆粒中菊苣酸、甘草酸的含量，計(jì)算保留率，并測定各個(gè)藥液的特征圖譜，以中試提取液（T601）為參照圖譜，計(jì)算相似度，并以5號峰（綠原酸）為參照峰（S），計(jì)算各個(gè)峰的相對峰面積。結(jié)果見圖6和表16、表17。

圖6 新清毒飲顆粒中試工藝提取液-浸膏-顆粒的特征圖譜疊加圖Figure 6 Superimposed characteristic chromatograms of pilotprocess extraction-extractum-granule of Xinqingduyin Granules

表15 新清毒飲顆粒中試工藝的相關(guān)結(jié)果Table 15 The corresponding results of pilot process steps of Xinqingduyin Granules

表16 新清毒飲顆粒中試工藝提取液-浸膏-顆粒的特征圖譜相對峰面積結(jié)果Table 16 The relative peak area of characteristic peaks of pilot-process extraction-extractum-granule of Xinqingduyin Granules

表17 新清毒飲顆粒中試工藝提取液-浸膏-顆粒的指標(biāo)成分保留率結(jié)果Table 17 The results of the retention rate of index component for pilot-process extraction-extractum-granule of Xinqingduyin Granules

2.4.1 中試工藝相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果分析

2.4.1.1 特征圖譜 1～16 號峰在提取液-浸膏-顆粒的工藝過程中（見圖6），以T601色譜圖為參照，中試浸膏、顆粒的特征圖譜相似度分別為0.970、0.973，表明該工藝未對藥液成分種類造成顯著影響；同一工藝步驟中，提取液、浸膏、顆粒各批次樣品之間的相似度均為0.999，提示本中試工藝重復(fù)性良好。與提取液比較，顆粒劑中5、7、10、14、15 號峰相對峰面積有所減少，其余峰穩(wěn)定，表明該工藝對成分的含量稍有影響。見表16。

2.4.1.2 指標(biāo)成分保留率 從提取液到顆粒的中試工藝過程中（見表17），菊苣酸保留率由（76.11±0.99）%降低至（54.56±1.63）%，甘草酸由（77.96±1.79）%降低至（54.96±1.08）%，表明中試工藝過程成分保留率下降幅度較大。

2.4.2 中試顆粒與同批飲片湯劑比較 湯劑的制備[23]：按處方比例稱取17藥味飲片共181 g，共3份。加水沒過藥面2 cm，浸泡30 min（廣藿香、青蒿、薄荷除外），武火煮開后轉(zhuǎn)文火煎25 min。加入單獨(dú)浸泡30 min 的廣藿香、青蒿、薄荷，繼續(xù)煎煮5 min，過濾。藥渣加水沒過藥面2 cm，二次煎煮30 min。過濾，合并濾液，即得新清毒飲湯劑。依法測定湯劑的特征圖譜及指標(biāo)成分含量，計(jì)算保留率，與中試樣品比較分析。

2.4.2.1 特征圖譜分析 依次將3 批湯劑樣品的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件（2012 年版）”，以T1 號樣品色譜圖為參照，對3 批樣品色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark 峰匹配，生成對照色譜圖（R0）。同法，依次生成3批中試提取液對照色譜（R1）、浸膏對照色譜（R2）、顆粒對照色譜（R3），取R0～R3 的色譜圖導(dǎo)入上述軟件系統(tǒng)，以R1 為參照圖譜，計(jì)算相似度。結(jié)果顯示，從湯劑至成分顆粒均可見1～16 號特征峰（見圖7）。R0～R3 相似度結(jié)果為1.000、0.975、0.968、0.971，均大于0.96，證明經(jīng)過中試生產(chǎn)的新清毒飲顆粒與湯劑主要成分相似。

圖7 新清毒飲湯劑-中試顆粒的對照圖譜疊加圖Figure 7 Superimposed reference chromatogram of Xinqingduyin decoction-pilot-process granule

2.4.2.2 指標(biāo)成分保留率結(jié)果 湯劑中菊苣酸、甘草的保留率為（52.88±4.00）%、（45.21±1.71）%，與中試成品顆粒中菊苣酸、甘草酸保留率相比，雖然中試規(guī)模生產(chǎn)成品顆粒成分保留率呈現(xiàn)較大幅度降低，但結(jié)果均高于湯劑中的成分保留率（見表17和表18），結(jié)合特征圖譜，進(jìn)一步證明新清毒飲顆粒工藝路線的可靠性。

表18 與中試同批飲片制備的新清毒飲湯劑的指標(biāo)成分保留率Table 18 The retention rate of index component of Xinqingduyin decoction prepared from the same batch of decoction pieces as the pilot-batch

3 討論

3.1 新清毒飲湯劑、小試與中試樣品比較 本研究進(jìn)行中試驗(yàn)證前，通過放大投料量，按照優(yōu)選工藝制備3 批新清毒飲小試顆粒，取制備過程中的提取液、浸膏、顆粒樣品測定特征圖譜及含量，計(jì)算指標(biāo)成分保留率。以提取液樣品的色譜圖為參照，浸膏、顆粒的色譜圖相似度均大于0.9。對小試、中試工藝的樣品及湯劑中指標(biāo)成分保留率進(jìn)行比較（見表19），發(fā)現(xiàn)中試樣品中菊苣酸、甘草酸的保留率顯著下降，成品顆粒中菊苣酸保留率顯著低于小試工藝樣品的保留率，可能是大規(guī)模生產(chǎn)往往加熱時(shí)間較長，導(dǎo)致菊苣酸受熱分解，使其保留率下降[16]。中試提取、濃縮過程中甘草酸保留率較高，但在成品顆粒中顯著下降，其原因可能與一步制粒過程中的泵進(jìn)藥液速度、進(jìn)風(fēng)溫度、霧化壓力、噴射速度等影響因素有關(guān)[24-25]。但是，新清毒飲顆粒中菊苣酸、甘草酸保留率仍顯著高于新清毒飲湯劑。

表19 新清毒飲顆粒小試、中試工藝與傳統(tǒng)湯劑指標(biāo)成分的保留率比較[（±s），%]Table 19 Comparison of retention rate of the index component among small-pilot-trail process and traditional decoction of Xinqingduyin Granules[（±s），%]

表19 新清毒飲顆粒小試、中試工藝與傳統(tǒng)湯劑指標(biāo)成分的保留率比較[（±s），%]Table 19 Comparison of retention rate of the index component among small-pilot-trail process and traditional decoction of Xinqingduyin Granules[（±s），%]

樣品提取液浸膏顆粒小試工藝保留率菊苣酸78.89±3.59 74.66±3.41 67.60±1.74甘草酸58.47±2.81 57.19±3.23 55.42±5.25中試工藝保留率菊苣酸76.11±0.99 62.81±2.55 54.56±1.63甘草酸77.96±1.79 72.51±1.05 54.96±1.08湯劑保留率菊苣酸52.88±4.00甘草酸45.21±1.71

3.2 特征圖譜結(jié)果分析 中試樣品色譜圖及相對峰面積結(jié)果顯示，新清毒飲顆粒工藝過程樣品與對照圖譜相似度均大于0.9，表明該工藝過程中，樣品主要成分種類未發(fā)生顯著變化。5 號峰（綠原酸）、7 號峰（蘆丁）、10 號峰（歸屬金銀花的未知成分）、14 號峰（蒙花苷）、15 號峰（補(bǔ)骨脂素）的相對峰面積RSD 較大，表明這些成分含量存在較大的差異。另外，圖7中保留時(shí)間18.5 min處的未標(biāo)識峰，在成品顆粒中峰面積顯著減少，因此后期研究應(yīng)關(guān)注該成分是否為有效成分，并進(jìn)一步關(guān)注熱不穩(wěn)定有效成分的降解，通過優(yōu)化工藝，提高有效成分保留率，以期制備成藥效成分高、質(zhì)量均一的顆粒劑。

本研究在小試試驗(yàn)中對整個(gè)制備工藝進(jìn)行考察，確定了新清毒飲初步的生產(chǎn)工藝，利用中試規(guī)模加以驗(yàn)證，對評價(jià)工藝放大的穩(wěn)定性具有重要的意義；所建立的特征圖譜方法適用于新清毒飲顆粒各生產(chǎn)流程的質(zhì)量評價(jià)，為不同工藝過程產(chǎn)物的質(zhì)量控制提供了參考；中試工藝制得新清毒飲顆粒劑與同批次飲片制得湯劑的比較顯示，特征圖譜相似性高，菊苣酸、甘草酸保留率高，可為中藥復(fù)方制劑工藝研究提供參考。