酶法制備野黃芩素的工藝研究

程雨婕，劉云華，黃志芳，陳燕，劉玉紅，易進(jìn)海（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611130；. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041）

野黃芩素為4’，5，6，7-四羥基黃酮，其7-O-β-葡萄糖醛酸苷為野黃芩苷。野黃芩苷具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、改善心腦缺血、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[1-4]，但其口服生物利用度低、體內(nèi)半衰期短[5-7]。而野黃芩素具有更強(qiáng)的生物活性、口服易于吸收[4，8]，與野黃芩苷相比，其相對(duì)生物利用度為301.8%[9]，具有更好的藥用價(jià)值。野黃芩素在植物中的含有量很低，難以從相關(guān)植物中大量提取。目前野黃芩素主要采用化學(xué)合成[10-12]和酸水解[13-14]等方法制備，但多存在使用有毒溶劑、副產(chǎn)物多、高溫、操作復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)，因此亟需尋找新的野黃芩素制備途徑。相較于野黃芩素，野黃芩苷的來(lái)源較為豐富，廣泛分布于唇形科黃芩屬和菊科飛蓬屬植物中，因此，可從含有量相對(duì)較高的植物如燈盞細(xì)辛（燈盞花）中獲取野黃芩苷，再通過生物轉(zhuǎn)化的方法獲得野黃芩素[15]。黃芩莖葉葡萄糖醛酸水解酶（Scutellaria baicalensis stems and leaves glucuronic hydrolase，sbslGUS）是一類能夠水解β-葡萄糖醛酸苷鍵的酶，本課題組前期已對(duì)sbslGUS 進(jìn)行了提取工藝研究，并利用sbslGUS 酶解黃芩苷制備黃芩素。本研究提取燈盞花中的野黃芩苷，應(yīng)用sbslGUS 酶解野黃芩苷轉(zhuǎn)化為野黃芩素，經(jīng)分離純化獲得高純度的野黃芩素提取物，可為野黃芩素化合物的制備提供新的途徑。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260 型高效液相色譜儀系列（美國(guó)Agilent 公司）；KQ-300E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP型十萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q Integral 3 型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）；IKA C-MAG HS7 型加熱磁力攪拌器（德國(guó)IKA 公司）；Sorvall Lynx 4000型高速離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司）；R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；ZKF035型電熱真空干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）。

1.2 材料 黃芩莖葉采自陜西澄城，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院李青苗研究員鑒定，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的莖葉。燈盞花購(gòu)自云南澤生生物科技有限公司，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院李青苗研究員鑒定，為菊科植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.的干燥全草。野黃芩苷對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：DST191012-026），野黃芩素對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：DST191221-030），成都德思特生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；甲酸（色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法

2.1.1 高效液相色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～12 min，40% B；12～30 min，40%～55% B）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；進(jìn)樣量：5～10 μL。理論塔板數(shù)按野黃芩素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜圖見圖1。

2.1.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 取野黃芩苷對(duì)照品、野黃芩素對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL 含野黃芩苷163.2 μg、野黃芩素181.0 μg 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 燈盞花水煎液供試品的制備：取燈盞花切段，加水煎煮，濾過，得燈盞花水煎液。取燈盞花水煎液適量，置10 mL量瓶，加70%乙醇至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

酶解產(chǎn)物供試品的制備：取黃芩莖葉（粉碎過40 目篩），加10 倍水（第1 次多加4 倍）室溫?cái)嚢杼崛? 次，每次15 min，過濾，合并濾液，得sbslGUS 提取液；sbslGUS 提取液與燈盞花水煎液于一定溫度水浴酶解，加入3倍酶解體系量乙醇終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)移至量瓶中，超聲處理（300 W，40 kHz）20 min，放置至室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、4、5、10 mL至10 mL量瓶，加70%甲醇至刻度，搖勻，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。結(jié)果表明野黃芩苷、野黃芩素分別在8.16～163.2、9.05～181 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表1 野黃芩苷和野黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍Table 1 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges of scutellarin and scutellarein

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取一定濃度的混合對(duì)照品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示，野黃芩苷、野黃芩素的RSD分別為0.16%、0.05%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 配制供試品溶液，室溫放置，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣。野黃芩苷、野黃芩素峰面積的RSD分別為0.89%、0.62%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按供試品溶液制備方法平行制備6 份供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件依次平行測(cè)定，計(jì)算得野黃芩苷、野黃芩素質(zhì)量濃度的RSD分別為2.35%、1.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量的供試品溶液6 份，加入適量混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，混勻，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算得野黃芩苷、野黃芩素的平均回收率分別為100.88%、100.11%，RSD 分別為1.05%、0.73%，表明該方法回收率良好。

2.2 燈盞花提取工藝研究

2.2.1 吸水率試驗(yàn) 稱取燈盞花（切段）100 g，加水10 倍，回流提?。ㄖ蠓校? h后，浸泡過夜，濾除未被吸收的水液，計(jì)算吸水率約為479%。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中首次煎煮時(shí)多加5倍水補(bǔ)足藥材吸水量。

2.2.2 煎煮條件篩選[16]煎煮次數(shù)、加水量、煎煮時(shí)間為影響提取的主要因素，采用4 因素3 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)研究，優(yōu)選最佳煎煮條件。以野黃芩苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)煎煮次數(shù)（A）、加水量（B）、煎煮時(shí)間（C）進(jìn)行優(yōu)選。稱取燈盞花100 g（切段），共9 份，按L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案安排試驗(yàn)（見表2和表3），加水煎煮（第1 次多加5 倍），濾過，合并濾液，測(cè)量體積。取水煎液照供試品溶液的制備方法處理，即得1～9 號(hào)供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算水煎液中野黃芩苷總量。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal design

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test

由表3 可知，C 因素極差小于空白列，故將C 因素與空白列合并計(jì)算誤差。方差分析結(jié)果見表4。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

方差分析結(jié)果顯示，煎煮次數(shù)（A）有顯著性差異，加水量（B）無(wú)顯著性差異。由表3 正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素作用主次為A＞B＞C，最佳方案為A3B3C3，但三因素2、3水平間差異均不大，從節(jié)約能耗、降低成本、提高生產(chǎn)效率等考慮，選擇次佳水平，擬定燈盞花煎煮條件為A2B2C2。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取燈盞花（切段）100 g，按照擬定方案A2B2C2和最佳方案A3B3C3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3 次。結(jié)果見表5。由表5可知，擬定方案A2B2C2相較于最佳方案野黃芩苷提取率略有降低，但加水量、煎煮時(shí)間和次數(shù)均減少，應(yīng)為最優(yōu)方案。綜上，確定燈盞花提取工藝為：燈盞花切段，加10 倍水（第1 次多加5 倍）提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，得燈盞花水煎液。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 5 Results of verification test（n=3）

2.3 酶解條件研究[17-18]以野黃芩苷酶解轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)影響酶解效果的主要因素抗氧化劑、酶用量、酶解pH 值、溫度、反應(yīng)時(shí)間等酶解條件進(jìn)行考察。

野黃芩苷酶解轉(zhuǎn)化率＝m2×M1/（m1×M2）。m1為野黃芩苷質(zhì)量，m2為野黃芩素的實(shí)際測(cè)得量，M1為野黃芩苷的相對(duì)分子質(zhì)量，M2為野黃芩素的相對(duì)分子質(zhì)量。

2.3.1 抗氧化劑對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，分別加入1%亞硫酸鈉、1%亞硫酸氫鈉、1%偏重亞硫酸鈉，另設(shè)不加抗氧化劑對(duì)照（以燈盞花質(zhì)量計(jì)，下同），于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計(jì)算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別為78.0%、81.4%、83.1%、76.7%。結(jié)果表明，1%亞硫酸氫鈉和1%偏重亞硫酸鈉均能提高野黃芩苷的轉(zhuǎn)化率，其中1%偏重亞硫酸鈉效果更優(yōu)，故選擇1%偏重亞硫酸鈉作為抗氧化劑。

2.3.2 酶用量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、按照酶與底物之比（以生藥計(jì)）1∶5、1∶10、1∶20、1∶40，分別加入燈盞花水煎液5、10、20、40 mL，加1%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計(jì)算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別為86.2%、82.8%、74.5%、61.9%。結(jié)果表明，野黃芩苷的轉(zhuǎn)化率隨著酶用量的減小而逐漸降低，酶與底物之比為1∶5 時(shí)轉(zhuǎn)化率最高?？紤]實(shí)際生產(chǎn)成本，選擇酶與底物之比為1∶10，既減少酶的用量，同時(shí)也能獲得較高的轉(zhuǎn)化率。

2.3.3 pH 對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 取sbslGUS提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，加1%偏重亞硫酸鈉，調(diào)節(jié)酶解體系pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5，于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計(jì)算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別為72.7%、85.2%、86.1%、85.7%，表明在pH 5.5～6.5 轉(zhuǎn)化率可達(dá)85%以上，故選擇酶解pH值約6.0。

2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，加1%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃水浴分別酶解10、15、20、25 h。照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計(jì)算轉(zhuǎn)化率， 結(jié)果分別為82.7%、 82.8%、 83.2%、84.4%。結(jié)果表明，酶解10 h 已基本酶解完全，各酶解時(shí)間轉(zhuǎn)化率差異不大。

2.3.5 酶解溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，加1%偏重亞硫酸鈉，分別于35、40、45、50、55、60 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計(jì)算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別為79.9%、82.0%、82.5%、80.0%、64.4%、25.3%。結(jié)果表明，隨著酶解溫度的升高，野黃芩苷的轉(zhuǎn)化率增加，但≥55 ℃時(shí)，野黃芩苷轉(zhuǎn)化率迅速下降，提示溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致酶活力降低，從而影響野黃芩苷酶解，故選擇酶解溫度為40～45 ℃，此時(shí)野黃芩苷轉(zhuǎn)化率較高。

2.3.6 抗氧化劑用量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，分別加0.1%、0.5%、1%、2%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定各酶解樣品中野黃芩素含量，并計(jì)算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別為79.4%、82.3%、82.5%、83.4%。結(jié)果表明，野黃芩苷的轉(zhuǎn)化率隨著偏重亞硫酸鈉用量的增加而提高，0.5%偏重亞硫酸鈉即可使野黃芩苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)80%以上，從節(jié)省成本考慮，故選擇添加0.5%偏重亞硫酸鈉。

2.4 野黃芩素的分離 取sbslGUS 提取液1.5 mL、燈盞花水煎液10 mL，加0.5%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃水浴分別酶解10、15、20 h。測(cè)定水液和沉淀中野黃芩素的含量，計(jì)算水液中野黃芩素占比，結(jié)果分別為18.4%、13.4%、10.7%。表明酶解時(shí)間延長(zhǎng)有利于野黃芩素的沉淀分離，酶解20 h 水液中損失較小，故酶解時(shí)間選擇20 h。

綜上，由燈盞花制備野黃芩素工藝擬定為：取黃芩莖葉（粉碎過40 目篩），加10 倍水（第1 次多加4 倍）室溫?cái)嚢杼崛?次，每次15 min，濾過，合并濾液，得sbslGUS 提取液；取燈盞花切段（黃芩莖葉10 倍量），加10 倍水（第1 次多加5 倍）煎煮提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，得燈盞花水煎液；燈盞花水煎液與sbslGUS提取液混勻，加入0.5%偏重亞硫酸鈉，于45 ℃酶解20 h，除去上清液，沉淀抽濾，減壓干燥，即得野黃芩素粗提物。

2.5 酶解工藝放大試驗(yàn) 取燈盞花500 g 和黃芩莖葉50 g，按照擬定工藝進(jìn)行提取酶解。試驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果見表6。

表6 酶解試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 6 Results of enzymatic hydrolysis test（n=3）

2.6 野黃芩素純化工藝研究 為進(jìn)一步除去粗提物中雜質(zhì)，提高野黃芩素含量，采用乙醇提取、活性炭脫色和分步結(jié)晶精制純化粗提物。

2.6.1 野黃芩素純化工藝參數(shù)的確定 對(duì)乙醇濃度和乙醇用量進(jìn)行考察，比較70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇對(duì)粗提物中野黃芩素的提取效果。結(jié)果顯示，80%乙醇中野黃芩素溶解度最大，野黃芩素與80%乙醇料液比為1∶150（m/V）時(shí)，提取效果好。比較不同活性炭用量對(duì)提取液的脫色效果，結(jié)果顯示，加入相當(dāng)于粗提物質(zhì)量10%的活性炭，脫色效果好且野黃芩素?fù)p失小。

2.6.2 野黃芩素純化工藝試驗(yàn) 取粗提物，按野黃芩素與80%乙醇料液比1∶150（m/V）加入80%乙醇加熱回流30 min，再加入相當(dāng)于粗提物質(zhì)量10%的活性炭加熱回流30 min，趁熱抽濾。濾液濃縮至有明顯沉淀析出，靜置過夜，濾過，得沉淀Ⅰ；取濾液繼續(xù)濃縮靜置過夜，濾過，得沉淀Ⅱ；合并沉淀Ⅰ和Ⅱ，減壓干燥，即得高純度野黃芩素提取物。按照上述純化工藝進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果見表7。

表7 純化試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 7 Results of purification test（n=3）

野黃芩素粗提物經(jīng)乙醇提取、活性炭脫色、濃縮結(jié)晶純化后，野黃芩素含量由62%～64%提高至87%～89%。

3 討論

野黃芩素具有不穩(wěn)定的多酚羥基結(jié)構(gòu)，在酶解過程中易被氧化。有報(bào)道[19-20]在制備野黃芩素時(shí)多充入氮?dú)饣蚣涌寡趸瘎┍Ｗo(hù)目標(biāo)產(chǎn)物。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察充氮和加抗氧化劑對(duì)野黃芩苷轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果顯示，加抗氧化劑對(duì)野黃芩素的保護(hù)效果更優(yōu)。經(jīng)比較抗氧化劑的種類和用量，確定加0.5%偏重亞硫酸鈉。本研究探究了酶解時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果顯示酶解10 h 野黃芩苷基本酶解完全，延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率影響不大，但有利于水液中懸浮的野黃芩素沉淀，減少野黃芩素的損失，綜合考慮選擇酶解時(shí)間為20 h。

在考察野黃芩素的純化工藝時(shí)，采用分步結(jié)晶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行純化。粗提物經(jīng)乙醇提取、活性炭脫色、濃縮結(jié)晶，得到含量大于87%的野黃芩素，收率大于84%。該純化工藝操作簡(jiǎn)便，有機(jī)溶劑可回收重復(fù)使用，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。綜上，本研究應(yīng)用黃芩莖葉中提取得到的sbslGUS 酶解野黃芩苷制備高純度的野黃芩素提取物，工藝簡(jiǎn)便可行，適合工業(yè)化生產(chǎn)，為野黃芩素化合物的制備提供了新的途徑。