基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討射麻止喘液治療中性粒細(xì)胞型哮喘的分子機(jī)制

連樂(lè)燊，孟星汝，黃秀芳，周謹(jǐn)希，謝燕小，陶海瀾，蔣紫云，5，劉小虹（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院，廣東東莞 52000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 50405；4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州 50405；5. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 5070）

支氣管哮喘（Asthma）簡(jiǎn)稱哮喘，是一種由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。根據(jù)痰液中不同的炎癥細(xì)胞分布，可分成嗜酸粒細(xì)胞型哮喘（Eosinophilic asthma，EA）、中性粒細(xì)胞型哮喘（Neutrophilic asthma，NA）、混合細(xì)胞型哮喘（Mixed granulocytic asthma，MA）及寡細(xì)胞型哮喘（Paucigranulocytic asthma，PA）4 種表型[2]。其中NA 對(duì)激素的治療反應(yīng)性差，臨床癥狀比其他類型的哮喘更難控制，但其具體機(jī)制尚未完全明確[3-4]。

射麻止喘液是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院根據(jù)治療哮喘的臨床驗(yàn)方生產(chǎn)的醫(yī)院制劑（粵藥制字Z20071338），具有宣肺平喘、通絡(luò)解痙、化痰止咳的功效，用于支氣管哮喘及喘息性急慢性支氣管炎發(fā)作期。臨床研究顯示，射麻止喘液能改善支氣管哮喘急性發(fā)作患者的臨床癥狀[5]、肺功能[6]及外周血清炎癥因子白細(xì)胞介素5（IL-5）、IL-8 水平[7]。本課題組前期研究表明，射麻止喘液能調(diào)節(jié)哮喘模型動(dòng)物的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）失衡，改善炎癥反應(yīng)[8]，減輕氣道平滑肌細(xì)胞增殖[9]，但其對(duì)NA 的作用機(jī)制尚不清楚。故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討射麻止喘液對(duì)NA 的作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雌性6～8 周齡BALB/C 小鼠30 只，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXY（浙）2019-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0001，環(huán)境溫度：22～24 ℃，濕度：40%～50%，光照條件：12 h 明暗交替，動(dòng)物自由攝食飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批文號(hào)：20221014004。

1.2 藥物及主要試劑 射麻止喘液（組方：麻黃、射干、地龍、杏仁、半夏、細(xì)辛、桔梗、椒目、甘草），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，批號(hào)：20220901。雞卵清白蛋白（OVA，純度≥98%，貨號(hào)：A5503）、弗氏完全佐劑（CFA，貨號(hào)：F5881），德國(guó)Sigma 公司；醋酸地塞米松片（DEX），新鄉(xiāng)市長(zhǎng)樂(lè)藥業(yè)有限公司，貨號(hào)：H41020216；p-mTOR 抗體，武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號(hào)：Ap0094；HE染色試劑盒，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)：G1076；IL-8 ELISA 檢測(cè)試劑盒，深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào)：EMC104；Primer Script-RT（貨號(hào)：RR047A）、TB Green Premix Ex TaqTM（貨號(hào)：RR820A），日本TaKaRa公司。

1.3 主要儀器 HY-JSE01 型小動(dòng)物霧化給藥儀，北京元森凱德生物技術(shù)有限公司；Nanodrop 2000 型超微量紫外可見分光光度計(jì)、多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific 公司；Quant StudioTM5 Real-Time 熒光定量PCR 儀，美國(guó)ABI 公司；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Beckman 公司；Pannoramic MIDI 數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)，匈牙利3D HISTEC 公司；顯微鏡，日本尼康公司。

1.4 射麻止喘液活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選 射麻止喘液由麻黃、射干、地龍、杏仁、半夏、細(xì)辛、桔梗、椒目、甘草9味中藥組成，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索射麻止喘液中除地龍外的其余8味藥的化學(xué)成分，并以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18 為條件，篩選出射麻止喘液的活性成分；動(dòng)物藥地龍通過(guò)文獻(xiàn)檢索及Swiss ADME 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swissadme.ch/index.php）篩選獲得活性成分。運(yùn)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及SwissTargetPrediction 平 臺(tái) （http：//www.swisstargetprediction.ch）預(yù)測(cè)射麻止喘液活性成分的作用靶點(diǎn)，將候選化合物及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Excel 軟件，并使用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）獲取規(guī)范基因名稱，去重后得到射麻止喘液的活性成分-作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.5 NA 疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選 利用OMIM（http：//www.omim.org）、GeneCards（https：//www.genecards.org）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org）及DrugBank（https：//go.drugbank.com）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Neutrophilic asthma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得NA 疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出的疾病靶點(diǎn)以“Relevant Score”所在的隊(duì)列數(shù)值為目標(biāo)，計(jì)算該列中位數(shù)，篩選出“Relevant Score”值＞中位數(shù)的靶點(diǎn)，并與其他數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的靶點(diǎn)合并、去重后，得到NA 疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.6 “中藥-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)微生信平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對(duì)上述預(yù)測(cè)得到的射麻止喘液活性成分作用靶點(diǎn)與NA 疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集并生成韋恩圖，即得到射麻止喘液治療NA 的潛在作用靶點(diǎn)（共有靶點(diǎn)）。分別將射麻止喘液所含中藥、活性成分及共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8軟件，構(gòu)建“中藥-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.7 潛在作用靶點(diǎn)的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將射麻止喘液治療NA 的潛在作用靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.string-db.org），模式選擇“Multiple Protein”，物種選擇“Homo sapiens”，選取置信度（Minimum required interaction score）＞0.4，建立潛在作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)。將PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系保存為Tsv 文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8 軟件中，進(jìn)一步使用內(nèi)置Mcode 插件分析獲得核心靶點(diǎn)。

1.8 潛在作用靶點(diǎn)的GO 功能及KEGG 通路富集分析 使用Metascape 平臺(tái)（http：//metascape.org/gp/index）對(duì)射麻止喘液治療NA 的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）、京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析；以P＜0.05對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選，獲得射麻止喘液治療NA 的生物過(guò)程（Biological Process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）以及信號(hào)通路。分別將篩選得到的GO 功能富集分析結(jié)果前10 項(xiàng)及KEGG 通路富集分析結(jié)果前20 項(xiàng)導(dǎo)入微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化。

1.9 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.9.1 分組、模型復(fù)制及給藥 將BALB/C 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組、NA 模型組、射麻止喘液低劑量組、射麻止喘液高劑量組、地塞米松對(duì)照組，每組6 只。通過(guò)腹腔注射致敏劑（OVA+CFA）及霧化吸入激發(fā)的方法復(fù)制NA 小鼠模型[10-11]。①致敏階段：除空白組外，其余各組小鼠在第0、7、14 天分別腹腔注射20 μg OVA+75 μg CFA（0.3 mL）致敏，空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。②激發(fā)給藥階段：第21～30天，采用霧化箱進(jìn)行霧化激發(fā)，激發(fā)藥物為5% OVA 混懸液（每次8 mL，每次霧化時(shí)間40 min，每天1 次），空白組采用等量生理鹽水霧化。同時(shí)于霧化激發(fā)前1 h 灌胃或腹腔注射給藥，每天1次。按照人與動(dòng)物間體表面積折算等效劑量，射麻止喘液低、高劑量組分別按照2.5、10 g·kg-1劑量灌胃給藥；空白組及NA 模型組給予10 mL·kg-1生理鹽水灌胃；地塞米松對(duì)照組腹腔注射1 mg·kg-1地塞米松，每天1次。

1.9.2 肺組織病理學(xué)觀察 取小鼠肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后，剪去多余結(jié)締組織；采用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成約4 μm薄片；二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗脫后，進(jìn)行HE常規(guī)染色，封片后在顯微鏡下觀察，并用數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)采集圖像。

1.9.3 ELISA 法檢測(cè)肺泡灌洗液中IL-8 含量 將小鼠麻醉后固定于取材臺(tái)上，充分暴露氣管，留置固定導(dǎo)管，暴露胸腔；用無(wú)菌手術(shù)線結(jié)扎右肺，使用1 mL 注射器抽取0.3 mL 預(yù)冷的生理鹽水，勻速自導(dǎo)管注入左肺后回抽（回抽率80%以上），反復(fù)抽吸3 次；將留取的肺泡灌洗液（BALF）以4 ℃、2 000 r·min-1（離心半徑8 cm）離心5 min，吸取上清液，-80 ℃保存。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟操作，測(cè)定肺泡灌洗液中IL-8含量。

1.9.4 RT-qPCR法檢測(cè)肺組織NLRP3、CXCR2 mRNA表達(dá)水平 采用TRIzol 法提取小鼠肺組織總RNA，檢測(cè)RNA 含量和純度。采用Prime Script-RT 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：42 ℃、15 min，85 ℃、5 min，將提取的總RNA 轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后采用TB Green Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，退火，60 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析范圍：65～95 ℃，每5 s 升溫0.5 ℃，每0.5 ℃記錄1 次熒光信號(hào)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以β-actin 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列由北京擎科生物科技股份有限公司提供，見表1。

表1 PCR 引物序列表Table 1 Primer sequences of PCR

1.9.5 免疫組化法檢測(cè)肺組織p-mTOR蛋白表達(dá)水平取肺組織石蠟切片，脫蠟并清洗后，用0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液煮沸熱修復(fù)抗原；室溫冷卻后用PBS清洗3 次，山羊血清室溫下孵育；PBS 清洗3 次后，加入一抗p-mTOR（稀釋比例1∶50），4 ℃下孵育過(guò)夜；室溫下復(fù)溫后PBS 清洗3 次，滴加酶標(biāo)二抗，室溫下孵育1 h；PBS 清洗3 次，滴加DAB 顯色液顯色5～10 min；PBS 清洗，蘇木素復(fù)染約3 min 后常規(guī)脫水；二甲苯透明，干燥后樹脂封固；在光學(xué)顯微鏡下觀察，棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 射麻止喘液治療NA 的“中藥-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 結(jié)果共篩選得到射麻止喘液活性成分作用靶點(diǎn)826 個(gè)，NA 疾病相關(guān)靶點(diǎn)154 個(gè)。對(duì)射麻止喘液活性成分作用靶點(diǎn)與NA 疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，即得到射麻止喘液治療NA的51個(gè)潛在作用靶點(diǎn)（共有靶點(diǎn)），生成韋恩圖見圖1。

圖1 射麻止喘液治療中性粒細(xì)胞型哮喘（NA）的潛在作用靶點(diǎn)Figure 1 Potential targets of Shema Zhichuan Liquid in the treatment of neutrophilic asthma

分別將射麻止喘液所含中藥、活性成分及共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8軟件，構(gòu)建“中藥-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)由205 個(gè)節(jié)點(diǎn)（9 個(gè)中藥、145 個(gè)活性成分、51 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)）、667 條邊構(gòu)成，節(jié)點(diǎn)之間的連線表示藥物、活性成分、靶點(diǎn)基因之間的作用關(guān)系。通過(guò)對(duì)該網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)一步分析，根據(jù)度值（Degree）大小進(jìn)行排列，排前5 位的活性成分為：槲皮素、木犀草素、山柰酚、豆甾醇、柚皮素，見表2；排前5 位的潛在作用靶點(diǎn)為：ESR1、ADRB2、CASP1、MAPK1、RELA。上述活性成分和靶點(diǎn)可能在射麻止喘液治療NA 中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖2 射麻止喘液治療中性粒細(xì)胞型哮喘的“中藥-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Figure 2 “Chinese medicinals-active components-potential targets” network of Shema Zhichuan Liquid in the treatment of neutrophilic asthma

表2 射麻止喘液治療中性粒細(xì)胞型哮喘的關(guān)鍵活性成分Table 2 Key active components of Shema Zhichuan Liquid in the treatment of neutrophilic asthma

2.2 射麻止喘液治療NA 潛在作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)將射麻止喘液治療NA 的51 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，去除2個(gè)游離節(jié)點(diǎn)，該網(wǎng)絡(luò)由49 個(gè)節(jié)點(diǎn)、568 條邊組成，見圖3-A。利用Cytoscape 3.8 軟件的內(nèi)置插件Mcode 對(duì)該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行參數(shù)特征計(jì)算，共得到29 個(gè)核心靶點(diǎn)（見圖3-B），包括AKT1（蘇氨酸蛋白激酶1）、IL6（白細(xì)胞介素6）、TNF（腫瘤壞死因子）、EGFR（表皮生長(zhǎng)因子）、NLRP3（NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3）、RELA（核因子κB）、MIF（巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子）、CXCR2（CXC 趨化因子受體2）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）等，各節(jié)點(diǎn)Degree 值接近，越靠近中心表示該靶點(diǎn)越重要。

圖3 射麻止喘液治療中性粒細(xì)胞型哮喘的潛在作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of potential targets of Shema Zhichuan Liquid in the treatment of neutrophilic asthma

2.3 潛在作用靶點(diǎn)的GO 功能及KEGG 通路富集分析 通過(guò)Metascape 平臺(tái)對(duì)射麻止喘液治療NA 的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能及KEGG 通路富集分析，結(jié)果見圖4。GO 功能富集分析（見圖4-A）得到882 個(gè)生物學(xué)過(guò)程條目，主要包括細(xì)胞對(duì)脂多糖、細(xì)菌來(lái)源分子、生物刺激、脂質(zhì)的反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等；33個(gè)細(xì)胞組分條目，主要集中在細(xì)胞膜閥、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、細(xì)胞膜微區(qū)等；61 個(gè)分子功能條目，包括各種因子結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、受體蛋白結(jié)合等。KEGG 通路富集分析（見圖4-B）共得到142 條信號(hào)通路（P＜0.05），大多數(shù)靶點(diǎn)富集在癌癥通路、TNF 信號(hào)通路、甲型流感信號(hào)通路、Toll 樣受體通路、MAPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等。

圖4 射麻止喘液治療中性粒細(xì)胞型哮喘的潛在作用靶點(diǎn)的GO 功能及KEGG 通路富集分析Figure 4 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of Shema Zhichuan Liquid in the treatment of neutrophilic asthma

2.4 射麻止喘液對(duì)NA 小鼠肺組織病理變化的影響結(jié)果見圖5。空白組小鼠的氣道黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，各層次結(jié)構(gòu)排列整齊，未見明顯壞死、脫落以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且肺泡結(jié)構(gòu)正常、間隔較薄，間質(zhì)無(wú)明顯纖維組織增生。與空白組比較，NA 模型組小鼠的氣道黏膜上皮結(jié)構(gòu)破損、紊亂，有局灶性脫落，氣管及血管周圍伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見部分區(qū)域黏液腺、平滑肌增生，伴有部分黏膜下層充血、水腫，且肺泡壁明顯增厚，肺泡腔縮小。與NA模型組比較，射麻止喘液低、高劑量組小鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列可見少許紊亂，氣管及血管周圍有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜充血水腫明顯減輕。而地塞米松對(duì)照組的改善不明顯，可見氣道黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞，氣管及血管周圍有大量炎性細(xì)胞聚集，黏膜充血、水腫等。結(jié)果提示，射麻止喘液能改善NA小鼠的肺組織病理?yè)p傷。

圖5 射麻止喘液對(duì)中性粒細(xì)胞型哮喘（NA）小鼠肺組織病理變化的影響（HE 染色，×200）Figure 5 Effect of Shema Zhichuan Liquid on histomorphological changes in the lung tissue of neutrophilic asthma mice（HE staining，×200）

2.5 射麻止喘液對(duì)NA 小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子IL-8 水平的影響 結(jié)果見圖6。與空白組比較，NA模型組小鼠肺泡灌洗液中的IL-8 水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，射麻止喘液高劑量組小鼠肺泡灌洗液中的IL-8 水平明顯降低（P＜0.05）。射麻止喘液低劑量組及地塞米松對(duì)照組小鼠肺泡灌洗液中的IL-8 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）。結(jié)果提示，射麻止喘液能改善NA小鼠的氣道炎癥反應(yīng)。

圖6 射麻止喘液對(duì)中性粒細(xì)胞型哮喘（NA）小鼠肺泡灌洗液中IL-8 水平的影響（±s，n=3）Figure 6 Effect of Shema Zhichuan Liquid on the level of IL-8 in bronchoalveolar lavage fluid of neutrophilic asthma mice（±s，n=3）

2.6 射麻止喘液對(duì)NA 小鼠肺組織NLRP3、CXCR2 mRNA 表達(dá)及p-mTOR 蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖7。與空白組比較，NA 模型組小鼠肺組織NLRP3、CXCR2 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），p-mTOR 蛋白表達(dá)水平（棕色為陽(yáng)性表達(dá)）明顯升高。與NA 模型組比較，射麻止喘液低劑量組小鼠肺組織NLRP3 mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），射麻止喘液低、高劑量組小鼠肺組織CXCR2 mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），p-mTOR蛋白表達(dá)水平明顯降低。

圖7 射麻止喘液對(duì)中性粒細(xì)胞型哮喘（NA）小鼠肺組織中CXCR2、NLRP3 mRNA 表達(dá)及p-mTOR 蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effects of Shema Zhichuan Liquid on mRNA expressions of CXCR2，NLRP3 and protein expression of p-mTOR in lung tissue of neutrophilic asthma mice

3 討論

研究[1]表明，哮喘是一種異質(zhì)性疾病，其在不同患者個(gè)體間存在差異。異質(zhì)性與中醫(yī)學(xué)的“同病異治”有異曲同工之意，不同炎癥表型的哮喘患者具有不同的中醫(yī)發(fā)病病機(jī)[12]。有研究[7]認(rèn)為，中性粒細(xì)胞型哮喘（NA）多由風(fēng)邪羈戀不散，引動(dòng)體內(nèi)宿痰所致，故治療NA 宜從風(fēng)痰論治，以“祛風(fēng)化痰”為基本治則。射麻止喘液由《金匱要略》中的射干麻黃湯化裁而來(lái)，具有疏風(fēng)化痰、解痙平喘的功效，符合NA 的中醫(yī)病機(jī)。前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究[5-9]已證實(shí)射麻止喘液對(duì)哮喘療效確切，然而其對(duì)NA 的分子作用機(jī)制尚不清晰。因此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[13]探究了射麻止喘液對(duì)NA 的作用機(jī)制，并進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究篩選出射麻止喘液中治療NA 的主要活性成分包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、豆甾醇、柚皮素等。槲皮素具有抗氧化損傷、抗炎、抗癌等藥理作用，相關(guān)研究[14-15]顯示，其能夠降低哮喘氣道敏感性，抑制氣道炎癥。木犀草素能通過(guò)調(diào)控MAPK/AP-1、JAK-STAT 等多種炎癥信號(hào)通路，改善NA 發(fā)生發(fā)展中的氣道炎癥[16]。山柰酚可以抑制經(jīng)典炎癥通路激活，減少肥大細(xì)胞釋放組胺及炎癥因子IL-6、TNF-α，從而有效減輕肺部炎癥[17-18]。柚皮素可抑制Th2 炎性細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫平衡，從而減緩哮喘的發(fā)生發(fā)展[19]。以上結(jié)果提示，射麻止喘液活性成分可能通過(guò)參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫平衡途徑在治療NA中發(fā)揮作用。

通過(guò)構(gòu)建潛在作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)了射麻止喘液治療NA 的核心靶點(diǎn)，包括NLRP3（NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3）、CXCR2（CXC 趨化因子受體2）、MIF（巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子）、EGFR（表皮生長(zhǎng)因子）、RELA（核因子κB）等。NLRP3 炎癥小體是固有免疫系統(tǒng)識(shí)別受體家族主要成員之一，在NA 的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[20]，NLRP3 炎性小體活化能夠促進(jìn)Caspase-1 的產(chǎn)生及炎癥因子釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集[21]。有研究[22]發(fā)現(xiàn)，OVA 誘導(dǎo)小鼠致敏后NLRP3表達(dá)與小鼠氣道高反應(yīng)呈正相關(guān)。使用NLRP3 抑制劑可有效減輕哮喘患者的氣道高反應(yīng)性[23]。中性粒細(xì)胞是哮喘免疫發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞，可通過(guò)CXC 趨化因子激活CXCR2 而啟動(dòng)，進(jìn)而被募集至哮喘患者氣道中，加劇哮喘進(jìn)展[24]。有研究[25]表明，通過(guò)抑制CXCR2 過(guò)表達(dá)可抑制中性粒細(xì)胞向肺部遷移，從而減少重癥哮喘患者誘導(dǎo)痰中的中性粒細(xì)胞水平。本研究結(jié)果顯示，射麻止喘液能夠下調(diào)NA 小鼠肺組織NLRP3、CXCR2 mRNA 表達(dá)，降低炎癥因子IL-8水平，說(shuō)明射麻止喘液有抑制NA 的中性粒細(xì)胞性炎癥反應(yīng)的作用。

KEGG 通路富集分析顯示，射麻止喘液治療NA的主要通路包括TNF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、mTOR 信號(hào)通路等。TNF 介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫、腫瘤免疫等多種生理病理過(guò)程。TNF 通路激活促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，如TNF-α、IL-8 等進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，趨化相關(guān)炎癥細(xì)胞聚集，形成進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)的信號(hào)[26-28]；IL-8 是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志[29]，可激活中性粒細(xì)胞向氣道聚集浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)及加劇炎癥反應(yīng)[30]。當(dāng)TNF通路傳導(dǎo)異常時(shí)，可激活肺泡上皮細(xì)胞中的趨化因子受體CXCR2，進(jìn)而募集中性粒細(xì)胞，放大肺部炎癥的連鎖反應(yīng)，加速炎癥發(fā)展[31]。MAPK 是調(diào)控細(xì)胞炎性反應(yīng)的重要信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，是哮喘發(fā)生發(fā)展的另一條重要途徑[32]。當(dāng)氣道上皮細(xì)胞受到刺激后，能激發(fā)p38MAPK 磷酸化后大量釋放炎性介質(zhì)，引發(fā)氣道炎性反應(yīng)[33]。被激活的MAPK 進(jìn)一步激活下游相關(guān)通路，調(diào)控多種炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，如促進(jìn)炎癥小體NLRP3表達(dá)，加速NA發(fā)生發(fā)展[34]。Toll 樣受體（Tolllike receptors，TLRs）是固有免疫系統(tǒng)的主要組成部分，已被證實(shí)能夠調(diào)控哮喘氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑的發(fā)生[35]，其激活后能調(diào)控免疫系統(tǒng)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[36]。mTOR 信號(hào)通路在自噬、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、分化存活等方面具有重要作用[37]，其介導(dǎo)的自噬途徑參與了NA 表型的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性等過(guò)程[38]。mTOR 過(guò)度表達(dá)會(huì)抑制自噬，導(dǎo)致氣道出現(xiàn)中性粒細(xì)胞性炎癥，引起巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3 炎性小體形成增多，并刺激炎癥因子產(chǎn)生，加劇氣道炎癥及導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高[39-40]。因此，抑制mTOR、NLRP3 炎性小體及CXCR2 表達(dá)能減輕NA 的氣道炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，射麻止喘液能改善NA 小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，降低IL-8 水平，可能與其抑制mTOR通路激活自噬途徑有關(guān)。

綜上所述，射麻止喘液可能是通過(guò)槲皮素、木犀草素、山柰酚等主要活性成分，作用于NLRP3、CXCR2等核心靶點(diǎn)，調(diào)控TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Toll 樣信號(hào)通路、mTOR 等關(guān)鍵信號(hào)通路，發(fā)揮抑制氣道炎癥反應(yīng)、促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡、緩解氣道重塑的作用，從而達(dá)到治療NA 的目的。本研究可為射麻止喘液治療NA 的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供參考，但相關(guān)研究結(jié)果仍有待進(jìn)一步的生物學(xué)驗(yàn)證。