HPLC-MS/MS 法同時測定清開靈口服液中7 種成分的含量

吳錦云，蔡凱偉，陳紅英，王家祺，潘碧妍，謝智勇，廖瓊峰［. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 50006；. 廣州白云山明興制藥有限公司，廣東廣州 5050；. 中山大學(xué)藥學(xué)院（深圳），廣東深圳 58406］

清開靈口服液處方來源于“溫病三寶”中的安宮牛黃丸，是由膽酸、豬去氧膽酸、珍珠母、水牛角、梔子、板藍(lán)根、金銀花和黃芩苷制成的中藥制劑，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神的功效，用于外感風(fēng)熱時毒、火毒內(nèi)盛所致發(fā)熱、咽喉腫痛、舌質(zhì)紅絳、苔黃、脈數(shù)者。針對當(dāng)前新冠疫情流行現(xiàn)狀，臨床上也有將其應(yīng)用于新型冠狀病毒感染的治療[1]。因此，清開靈口服液具有較高的臨床使用價值和良好的經(jīng)濟(jì)效益。2020 年版《中國藥典》（一部）規(guī)定對清開靈口服液中的膽酸、梔子苷和黃芩苷進(jìn)行含量測定[2]。但對于一個由5 味中藥及3 種中藥成分組成的制劑，僅測定其中的3種成分，難以全面控制制劑的質(zhì)量。目前已有報道[3-5]清開靈口服液中一種或多種成分的含量測定方法。同時清開靈其他劑型的含量測定亦有較多報道[6-9]。但其中應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）法測定的時間較長，應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC - MS/MS）法則未對板藍(lán)根中的有效成分進(jìn)行含量測定。相關(guān)文獻(xiàn)表明，清開靈口服液中的豬去氧膽酸[10-11]、板藍(lán)根成分腺苷[12-13]、金銀花成分綠原酸和咖啡酸[14-15]均具有抗炎、抗病毒等藥理活性。因此，本研究基于成分有效性及可測性原則，根據(jù)清開靈口服液的處方組成，選擇了《中國藥典》中規(guī)定的3 種成分膽酸、梔子苷、黃芩苷，同時增加了豬去氧膽酸、綠原酸、咖啡酸和腺苷4 種成分，采用HPLC-MS/MS 技術(shù)建立清開靈口服液的含量測定方法，以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜-6460 三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent Technologies 公司）；Vortex Mixer XW-80A 型渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ-250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AS62.R2型十萬分之一電子天平（波蘭RADWAG 公司）；JA/YP 型萬分之一電子天平（瑞士METTLER TOLEDO 有限公司）。

1.2 藥物和試劑 16 批清開靈口服液（廣州白云山明興制藥有限公司，批號分別為1221020、1230510、1230511、1230515、1230602、1230603、1230604、1230606、1230608、1230609、1230610、1230611、1230612、1230613、1230614、12300615）。腺苷、綠原酸、梔子苷、黃芩苷、豬去氧膽酸和膽酸（含量均≥98.0%，中國食品藥品檢定研究所，批號分別為110879-202204、110753-202119、110749-201919、110715-202223、100087-201411 和100078-201808）；咖啡酸（含量≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司，批號：M27GB143417）；甲醇（色譜純，德國默克化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨（色譜純，上海晶純生化科技股份有限公司）；甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×10 mm，1.7 μm）；流動相：含10 mmol·L-1乙酸銨和0.1%甲酸的水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～3.5 min，80%A；3.5～5 min，80%A→10%A；5～12.2 min，10%A）；柱溫：30 ℃；流速：0.15 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源采用電噴霧離子源（ESI），正/負(fù)離子模式進(jìn)行掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行分析，干燥氣（氮?dú)猓囟葹?00 ℃，干燥氣流速為5 L · min-1，霧化氣（氮?dú)猓毫?5 psi，鞘氣（氮?dú)猓囟葹?00 ℃，鞘氣流速為11 L·min-1，毛細(xì)管電壓為3 500 V，噴嘴電壓為500 V。7 種化合物的裂解電壓及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 清開靈口服液中7 種化合物的質(zhì)譜測定參數(shù)Table 1 The mass spectral parameters of 7 components in Qingkailing Oral Liquid

2.2 溶液的配制

2.2.1 樣品溶液的制備 分別精密量取15個批次的清開靈口服液0.25 mL，置于10 mL 的容量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得15個批次供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備液及混合對照品儲備溶液的制備分別取腺苷、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、黃芩苷、豬去氧膽酸和膽酸對照品適量，精密稱定，分別置于7 個10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為1.004、0.998、0.998、0.996、1.002、1.005 和1.037 mg·mL-1的對照品儲備液。分別精密量取各對照品儲備液適量，用50%甲醇配成質(zhì)量濃度分別為4.016、14.97、3.992、24.90、501.0、50.25 和155.5 μg·mL-1的混合對照品儲備溶液。

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對照品儲備溶液2 mL，置于10 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，得混合對照品溶液。取混合對照品溶液及“2.2.1”項(xiàng)下的樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，腺苷、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、黃芩苷、豬去氧膽酸和膽酸在各自的離子通道內(nèi)均能出峰，且無干擾，表明該方法的專屬性良好。MRM 圖譜見圖1。

圖1 清開靈口服液中7 種成分的MRM 提取離子流圖Figure 1 The MRM chromatograms of 7 investigated components in Qingkailing Oral Liquid

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對照品儲備溶液0.25、0.5、1、2、4、6、8 mL，置于10 mL 容量瓶中，加50%甲醇水稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，每個成分取5 個濃度點(diǎn)，腺苷、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、黃芩苷、豬去氧膽酸和膽酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）見表2。

表2 清開靈口服液中7 種成分的線性范圍和回歸方程Table 2 Linear ranges，regression equations of 7 components in Qingkailing Oral Liquid

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6 次分析，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示，腺苷、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、黃芩苷、豬去氧膽酸和膽酸峰面積的RSD分別為1.53%、2.48%、0.91%、1.66%、1.65%、2.03%和1.09%，表明該儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液（批號：1221020）6 份，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示，腺苷、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、黃芩苷、豬去氧膽酸和膽酸峰面積的RSD 分別為2.89%、2.14%、1.99%、1.28%、1.73%、1.53%和1.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號：1221020），分別于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示，腺苷、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、黃芩苷、豬去氧膽酸和膽酸峰面積的RSD分別為1.81%、2.99%、2.26%、1.06%、3.00%、2.41%和0.62%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的清開靈口服液6 份（批號：1221020），每份0.125 mL，分別加入腺苷、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、黃芩苷、豬去氧膽酸和膽酸質(zhì)量濃度分別為5.02、16.69、9.98、37.85、501.00、70.35 和186.66 μg·mL-1的混合對照品溶液1 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試溶液。按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，腺苷、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、黃芩苷、豬去氧膽酸和膽酸的平均回收率分別為100.9%、98.74%、 101.2%、 100.2%、 100.8%、 99.97% 和98.94%，RSD 分別為1.58%、0.59%、1.78%、1.25%、0.65%、1.69%和1.07%。見表3。

表3 清開靈口服液的回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 The results of recovery rate of Qingkailing Oral Liquid（n=6）

2.4 樣品測定 取15批清開靈口服液樣品各3份，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，使用外標(biāo)法計(jì)算7 種成分的含量。結(jié)果見表4。

表4 清開靈口服液中7 種成分的含量測定結(jié)果（mg·mL-1，n=3）Table 4 Contents of 7 components in of Qingkailing Oral Liquid（mg·mL-1，n=3）

3 討論

清開靈口服液處方中含8 味藥，成分復(fù)雜，采用HPLC-UV 法進(jìn)行檢測時，所需分析時間長，色譜峰干擾較多[6-7]，且處方中黃芩苷和梔子苷屬于黃酮類化合物，與有機(jī)酸類化合物綠原酸、咖啡酸和核苷類化合物腺苷的最大吸收波長不同，而膽酸、豬去氧膽酸僅有末端吸收，因此用HPLC-UV 法難以滿足上述成分的定量測定需求。HPLC-MS/MS 法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，故選擇此方法進(jìn)行測定。

本實(shí)驗(yàn)中考察了不同流動相對色譜峰峰型及響應(yīng)的影響，使用甲醇作為有機(jī)相時，各成分色譜峰響應(yīng)均優(yōu)于使用乙腈；在水中分別添加0.1%甲酸、5 mmol·L-1乙酸銨、10 mmol·L-1乙酸銨、0.1%甲酸和10 mmol·L-1乙酸銨進(jìn)行測定，結(jié)果表明，使用0.1%甲酸時，黃芩苷、腺苷色譜峰拖尾嚴(yán)重，使用5 及10 mmol·L-1乙酸銨時，黃芩苷及腺苷的峰型得到改善，而加入0.1%甲酸和10 mmol·L-1乙酸銨后，響應(yīng)值提高，峰型對稱，因此選擇甲醇-含10 mmol·L-1乙酸銨和0.1%甲酸的水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

2020 年版《中國藥典》 規(guī)定清開靈口服液“1 mL 含膽酸應(yīng)為1.50～3.50 mg，1 mL 含梔子苷不得少于0.2 mg，1 mL 含黃芩苷不得少于3.5 mg”。本研究15 批樣品中膽酸、梔子苷和黃芩苷的含量測定結(jié)果均符合規(guī)定。腺苷、綠原酸、咖啡酸和豬去氧膽酸在《中國藥典》的清開靈口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無相應(yīng)限度規(guī)定，本研究15批樣品含量測定結(jié)果表明，腺苷、綠原酸、咖啡酸和豬去氧膽酸各批次之間的含量較為接近，提示這4種成分可以考慮納入新的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中。

綜上所述，本研究建立了清開靈口服液中7 種成分的含量測定方法，對其質(zhì)量進(jìn)行較為全面的評價。本研究中測定的豬去氧膽酸、綠原酸、咖啡酸、腺苷在清開靈口服液中含量均較為接近，可為清開靈口服液的質(zhì)量控制和后續(xù)研究提供參考。