基于分子生物學(xué)技術(shù)的胞苷生產(chǎn)菌的育種研究進(jìn)展

范曉光，李燕軍

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

基于分子生物學(xué)技術(shù)的胞苷生產(chǎn)菌的育種研究進(jìn)展

范曉光，李燕軍

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

胞苷是一種重要的抗腫瘤、抗病毒藥物的中間體。傳統(tǒng)的胞苷生產(chǎn)菌的育種策略多采用物理或化學(xué)誘變的方法，結(jié)合代謝產(chǎn)物類似物的抗性篩選手段，得到能夠有效積累胞苷的菌株。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因敲除技術(shù)，通過阻斷細(xì)胞的代謝旁路或引入突變位點(diǎn)，能夠有效改變目的產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量。對代表性的胞苷生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的胞苷生物合成途徑進(jìn)行分析，并對其分子生物學(xué)育種策略進(jìn)行了綜述。

胞苷；分子生物學(xué)；合成途徑；育種策略

胞苷（Cytidine）是一種嘧啶核苷，常作為中間體用于制造阿糖胞苷（Ara-C）、環(huán)胞苷（Cyclo C）、三磷酸胞苷（CTP）、胞二磷膽堿（CDP-Choline）等抗腫瘤、抗病毒藥物。傳統(tǒng)的制備胞苷的方法主要為RNA水解法或化學(xué)合成法[1]，但均存在著分離提純繁瑣，生產(chǎn)成本過高的問題。與上述方法相比，直接發(fā)酵法具有成本低廉，副產(chǎn)物少的特點(diǎn)，但由于代謝途徑復(fù)雜，反饋?zhàn)瓒艉头答佉种茝?qiáng)烈，使得胞苷產(chǎn)量難于突破。因此，選育具有產(chǎn)量高、副產(chǎn)物少、發(fā)酵周期短、遺傳性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)的胞苷生產(chǎn)菌是直接發(fā)酵法生產(chǎn)胞苷的先決條件。

早期篩選胞苷生產(chǎn)菌株的方法多為誘變育種的方法。1989年，美國專利報道了具有胞苷脫氨酶缺失和嘧啶結(jié)構(gòu)類似物抗性遺傳標(biāo)記的生產(chǎn)胞苷的枯草芽孢桿菌（IFO13719）和巨大芽孢桿菌（ATCC6251）突變株；1994年，日本專利報道了具有胞苷脫氨酶活力缺失、6-雜氮尿嘧啶抗性、抗500 μg/mL 5-氟胞苷抗性突變株B.subtilis No. 344，能夠在發(fā)酵培養(yǎng)基中積累10.4 g/L胞苷；1995年，日本專利報道了3-脫雜氮尿嘧啶抗性突變株B.subtilis No.428，能夠在發(fā)酵培養(yǎng)基中積累14.2 g/L；后來日本專利陸續(xù)報道了具有胞苷脫氨酶缺失、3-脫雜氮尿嘧啶抗性、5-氟胞苷抗性、氨甲酰磷酸合成酶活力增強(qiáng)以及高絲氨酸脫氫酶活力缺失等特性的突變株，其最大胞苷產(chǎn)率穩(wěn)定在30 g/L左右。相比于國外，我國從2005年起才開始進(jìn)行胞苷生產(chǎn)菌的選育及發(fā)酵優(yōu)化研究。天津科技大學(xué)、華東理工大學(xué)等高校分別從發(fā)酵菌株和發(fā)酵條件等方面進(jìn)行了一系列的探索工作，但胞苷的生產(chǎn)水平依舊較低，僅為5～6 g/L[2-3]。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一系列新型的育種技術(shù)逐步運(yùn)用到微生物菌體的改造之中。例如蛋白質(zhì)（酶）分子定向進(jìn)化育種技術(shù)，基因敲除育種技術(shù)以及全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程技術(shù)等。隨著越來越多菌株測序工作的完成或穩(wěn)步推進(jìn)，應(yīng)用已有序列進(jìn)行基因的功能性分析已越來越迫切與重要。因此，從胞苷生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的代謝途徑出發(fā)，通過利用傳統(tǒng)誘變育種方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)育種技術(shù)，構(gòu)建和篩選出高產(chǎn)胞苷生產(chǎn)菌，這對提高我國胞苷生產(chǎn)水平具有十分重要的意義。

1 枯草芽孢桿菌的胞苷生物合成途徑

圖1 枯草芽孢桿菌嘧啶核苷生物合成及其代謝調(diào)控

枯草芽孢桿菌嘧啶核苷酸生物合成及代謝控制過程如圖1所示：

枯草芽孢桿菌的嘧啶生物合成基因簇（pyrgene cluster），位于其染色體上，大小為12.5 kb，這段基因簇包含了的十段順反子，多順反子的轉(zhuǎn)錄順序依次為pyrR、pyrP、pyrB、pyrC、pyrAA、pyrAB、pyrDII、pyrDI、pyrF、pyrE。其中pyrR編碼pyr弱化調(diào)節(jié)蛋白，pyrP編碼尿嘧啶通透酶，pyrB編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；福琾yrC編碼二氫乳清酸酶，pyrAA編碼氨甲酰磷酸合成酶谷氨酰胺酶亞基，pyrAB編碼氨甲酰磷酸合成酶催化亞基，pyrDII編碼二氫乳清酸脫氫酶電子遷移亞基，pyr-DI編碼二氫乳清酸脫氫酶催化亞基，pyrF編碼乳清酸單磷酸脫羧酶，pyrE編碼乳清酸磷酸核糖焦磷酸化酶。此外，pyr操縱子的三段非翻譯區(qū)域在pyr的弱化調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用[4-6]，這三段弱化區(qū)域分別位于5'端的前導(dǎo)序列（弱化區(qū)域1151 nt），pyrR和pyrP基因之間（弱化區(qū)域2173 nt），pyrP和pyrB基因之間（弱化區(qū)域3145 nt）。

2 枯草芽孢桿菌的育種策略

從枯草芽孢桿菌的生物合成途徑中不難看出，其從頭合成UMP是通過6個酶依次催化完成的。編碼這些酶的pyr基因簇的表達(dá)受到過量的尿嘧啶阻遏，并表現(xiàn)出協(xié)同調(diào)節(jié)。另一方面，對這些酶的反饋抑制或反饋激活調(diào)節(jié)主要集中在第一個UMP合成酶，即天冬氨酸氨甲酰磷酸合成酶（CPSase）?？傊琔MP生物合成酶的合成受到尿苷化合物的阻遏，同時可被胞嘧啶核苷酸和焦磷酸核糖（PRPP）激活，而CTP合成酶的合成受到胞苷化合物的阻遏，不受尿苷核苷酸的抑制。在誘變育種過程中要解除這些反饋抑制或阻遏，才能獲得嘧啶核苷酸積累的菌種。蘇靜等[7]采用同源重組的方法敲除枯草芽孢桿菌TS8的胞苷脫氨酶基因cdd，阻斷嘧啶代謝通量由胞苷流向尿苷和尿嘧啶。經(jīng)實驗驗證，cdd基因缺失菌株的胞苷比原始菌株提高了44.19%且遺傳性狀穩(wěn)定。方海田等[8]通過定點(diǎn)突變解淀粉芽孢桿菌中受UMP抑制的編碼氨甲酰磷酸合成酶亞基的carB基因，獲得了胞苷產(chǎn)量分別為野生菌株3.7倍和5.7倍的突變株。

3 大腸桿菌的胞苷生物合成途徑

大腸桿菌嘧啶核苷酸生物合成及代謝控制過程如圖2所示。大腸桿菌的操縱子主要由六個獨(dú)立的操縱子carAB、pyrBI、pyrC、pyrD、pyrE和 pyrF組成，這六個操縱子分別編碼UMP從頭合成途徑中涉及的六個酶，它們是不連序分散地位于染色體上。其中，carA編碼氨甲酰磷酸合成酶的谷氨酰胺酶亞基，carB編碼氨甲酰磷酸合成酶的催化亞基，pyrI編碼天冬氨酸-轉(zhuǎn)氨甲酰酶的調(diào)節(jié)亞基，pyrB編碼天冬氨酸-轉(zhuǎn)氨甲酰酶的催化亞基，pyrC編碼二氫乳清酸酶，pyrD編碼二氫乳清酸脫氫酶，pyrE編碼乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，pyrF編碼5-磷酸乳清核苷脫羧酶，pyrH編碼尿苷酸激酶，ndk編碼二磷酸核苷激酶，pyrG編碼胞苷三磷酸合成酶。

大腸桿菌操縱子的調(diào)節(jié)作用與枯草芽孢桿菌不同，比較復(fù)雜。其中，pyrBI、pyrE、pyrF操縱子的表達(dá)受尿苷酸的抑制，而pyrC和pyrD操縱子的表達(dá)主要受胞苷酸的抑制，carAB操縱子的表達(dá)對于嘧啶和精氨酸的生物合成是必須的，說明至少有兩個抑制物控制著嘧啶操縱子的轉(zhuǎn)錄[9-11]。此外，在嘧啶限制的情況下，嘧啶操縱子的表達(dá)抑制作用是不一致的，說明每個操縱子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用是個獨(dú)立的機(jī)制[12]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌操縱子的調(diào)節(jié)作用一共有三種方式[13-16]：1）pyrBI和pyrE操縱子表達(dá)的弱化控制作用，通過此操縱子上的一個弱化區(qū)域控制操縱子的轉(zhuǎn)錄終止；2）pyrC和pyrD操縱子表達(dá)受CTP與轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的結(jié)合，可產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄作用；3）pyrBI操縱子的第二個控制機(jī)制是轉(zhuǎn)錄起始的反復(fù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，此反復(fù)轉(zhuǎn)錄機(jī)制還參與carAB、嘧啶補(bǔ)救途徑操縱子codBA和upp-uraA的調(diào)節(jié)作用。

4 大腸桿菌的育種策略

與枯草芽孢桿菌不同，大腸桿菌中嘧啶核苷酸的生物合成只在三個控制點(diǎn)上受到終產(chǎn)物的反饋控制，催化這三步反應(yīng)的酶都是變構(gòu)酶。將天冬氨酸與氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘奔柞Ｌ於彼岬姆磻?yīng)是此途徑的關(guān)鍵步驟，催化該反應(yīng)的天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶受到終產(chǎn)物CTP的反饋抑制，它被抑制將影響尿苷酸和胞苷酸的合成。另兩個調(diào)節(jié)位點(diǎn)分別是由氨甲酰磷酸合成酶催化的反應(yīng)，它受UMP的反饋抑制；由CTP合成酶催化的反應(yīng)，受CTP的反饋抑制，它只影響胞苷酸的合成。

與枯草芽孢桿菌相比，大腸桿菌中受代謝產(chǎn)物抑制的酶較少且分散，因此目前對于大腸桿菌胞苷生產(chǎn)菌的分子生物學(xué)改造較多。蘇靜等[17]用過Red重組系統(tǒng)敲出了大腸桿菌MG3028基因組上的胞苷脫氨酶基因cdd，阻斷了胞苷的分解代謝。然后，構(gòu)建了含解淀粉芽孢桿菌TS8嘧啶操縱子結(jié)構(gòu)基因的重組質(zhì)粒pPYR3021，此操縱子編碼UMP從頭合成途徑中的6個關(guān)鍵酶，然后將其轉(zhuǎn)入E.coli MG3028（Δcdd）。與出發(fā)菌株相比，E.coli MG3028（Δcdd）的胞苷產(chǎn)量提高了近2倍，攜帶重組質(zhì)粒的菌株的胞苷產(chǎn)量則提高了近6倍。吳曉嬌等[18]通過過表達(dá)大腸桿菌中氨甲酰磷酸合酶和天冬氨酸氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶的操縱子基因carAB和pyrBI，分別獲得了比出發(fā)菌株胞苷產(chǎn)量高出85.3%和29.7%的基因工程菌株。方海田等[19]通過定點(diǎn)突變篩選到了抗反饋抑制的天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶ATCase，部分解除了胞苷三磷酸CTP對其的抑制，促進(jìn)了胞苷的積累。

圖2 大腸桿菌嘧啶核苷生物合成及其代謝調(diào)控

除了從頭合成途徑外，一些其他途徑中的代謝產(chǎn)物的變化也會影響到胞苷的合成。方海田等[20-21]發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中過表達(dá)編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶、6-磷酸果糖脫氫酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（PPP途徑中的三個關(guān)鍵酶）基因prs、zwf、gnd，胞苷產(chǎn)量與原始菌株相比提高了128%。在大腸桿菌中敲除胞苷脫氨酶基因cdd和高絲氨酸脫氫酶thrA（催化天冬氨酸到蘇氨酸），同時導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌中與UMP合成相關(guān)的操縱子pyrA和pyrB，重組菌的胞苷產(chǎn)量比原始菌提高了3倍。

5 結(jié)語

微生物生產(chǎn)核苷是近代發(fā)酵工程領(lǐng)域的杰出成果，目前在國外已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。近年來我國在胞苷生產(chǎn)菌的選育方面取得了一些進(jìn)展，但胞苷的整體發(fā)酵生產(chǎn)水平依然落后。因此只有從微生物的代謝途徑出發(fā)，將傳統(tǒng)的誘變育種與分子生物學(xué)育種結(jié)合起來，才能夠更有效的提高胞苷產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，獲得經(jīng)濟(jì)效益。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Research advance in cytidine production strain by molecular biology technology

FAN Xiaoguang,LI Yanjun
(College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Cytidine is an important intermediate for antitumor or antiviral drugs.Traditional method for screening of cytidine producing strain was generally based on physical or chemical mutation combined with resistance screening method of metabolic product analogues to obtain high yield strain.With the development of molecular biology technology,the yield or quality of target product can be effectively improved by gene knockout technology to block cell metabolic pathways or introduce mutant site.In this study,the biosynthetic pathways of cytidine in B.subtilis and E.coli were analyzed,and the breeding strategy for cytidine production strain was reviewed.

cytidine;molecular biology;synthetic pathway;breeding strategy

Q933

A

1674-2214（2015）01-0053-05

2014-11-25

范曉光（1987—），男，天津人，講師，博士，研究方向為氨基酸及有機(jī)酸的發(fā)酵過程控制，E-mail∶xiaoguangfan@tust.edu.cn.