參附注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠Nrf2 信號通路的影響①

江承平 吳碧華 王柏強(qiáng) 羅 飛 何效平 王曉明 劉黎明

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，南充 637007)

隨著我國老齡化人口的加劇，缺血性腦血管病的發(fā)病率、致死率和致殘率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)［1］。對于缺血性腦血管病的治療主要是在早期恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)，然而再灌注后導(dǎo)致的腦損傷可以導(dǎo)致缺血所致的結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙進(jìn)一步加重，因此，如何治療缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)損害，是目前研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。在以往研究中，本課題組及其他實(shí)驗(yàn)室均發(fā)現(xiàn)參附注射液可以在腦缺血再灌注損傷模型中發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用［2，3］，然而對于其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制，目前尚未完全闡明。Nrf2 是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族中的一員，以往研究發(fā)現(xiàn)其在腦缺血再灌注損傷、腦外傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血和脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷中的病理過程中發(fā)揮重要作用［4］，本文通過探討參附注射液對Nrf2 信號通路的影響，以期進(jìn)一步闡述參附注射液發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 68 只健康雄性成年SD 大鼠，體重230～270 g，清潔級，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號SCXK(川2008-18)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為:假手術(shù)組，腦缺血再灌注組，參附注射液治療組;參附注射液購自雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為: 991202;腦缺血再灌注模型的制作參照以往文獻(xiàn)［5］:使用水合氯醛(4 mg/kg)腹腔內(nèi)注射將大鼠麻醉后，固定于手術(shù)臺上，常規(guī)剔除頸毛消毒，鋪無菌巾，將頸部皮膚切開后，暴露、分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈，用絲線將頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎，并用絲線在頸外動(dòng)脈起始端結(jié)扎，采用微動(dòng)脈夾將頸內(nèi)動(dòng)脈的遠(yuǎn)端夾住，在頸總動(dòng)脈的備用線近端距離頸外動(dòng)脈分叉0.6 cm處，采用顯微剪刀剪開一小口，然后將先栓插進(jìn)頸總動(dòng)脈至微動(dòng)脈夾處，使用備用線扎緊，松開動(dòng)脈夾后，將線栓繼續(xù)插入到大腦中動(dòng)脈起始部，以阻斷大腦中動(dòng)脈的血流，當(dāng)大鼠右側(cè)虹膜顏色開始變淺時(shí)，開始記錄缺血時(shí)間，同時(shí)逐層縫合切口出組織，于缺血后2 h 小心抽出栓線以實(shí)現(xiàn)缺血再灌注。術(shù)中嚴(yán)密監(jiān)測大鼠的心率、血壓和體溫，使用電熱毯將大鼠體溫維持在生理范圍內(nèi)。參附注射液在術(shù)后1 h 通過尾靜脈注射(8 mg/kg)，假手術(shù)組和模型組于術(shù)后1 h 給予尾靜脈注射生理鹽水處理(8 mg/kg)，所有實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于清潔環(huán)境，室溫20℃～24℃，避免強(qiáng)光及噪聲刺激，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 大鼠外傷后神經(jīng)功能評分 大鼠缺血再灌注損傷后24 h 的神經(jīng)功能評分采用Longa 法［6］:0 分未出現(xiàn)神經(jīng)損傷癥狀，1 分不能完全伸展對側(cè)前爪;2 分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3 分:向?qū)?cè)傾倒;4 分:不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.3 Western blot 法檢測 腦缺血再灌注24 h 后，使用水合氯醛將大鼠麻醉，經(jīng)心尖灌注100 ml 的生理鹽水，取右側(cè)額頂葉腦皮質(zhì)放入-80℃冰箱中保存待用。細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白的提取參照試劑盒說明書進(jìn)行，Bradford 法蛋白定量，按1∶4比例加入5×loading 沸水中煮10 min，變性，按每孔加入35 μg蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入Nrf2、cleavedcaspase-3、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)，醌氧化還原酶1［NAD(P)H，quinine oxidoreductase 1，NQO1］，β-actin，H3(1∶1 000，均購自美國cell signaling 公司)一抗稀釋液，4℃搖床過夜，加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，洗膜，滴加ECL 發(fā)光液，曝光，Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 尼氏染色結(jié)果分析 尼氏染色步驟參考以往文獻(xiàn)［7］。石蠟切片(4 μm)經(jīng) 二甲苯中充分脫蠟后，將切片依次放入 無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min;然后放入尼氏染色液(碧云天)染色8 min，染色時(shí)溫度控制在37℃，蒸餾水洗滌2 次，95% 乙醇約5 s，可以用70%乙醇洗滌2 次后透明和封片，鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.5 免疫組化染色步驟 將石蠟包埋的腦切片常規(guī)脫蠟和水化，PBS 充分沖洗后，蒸餾水浸泡后抗原修復(fù)，洗滌后滴加過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育30 min。PBS 洗滌后滴加免疫血清封閉液(碧云天)，室溫孵育30 min 后滴加cleaved-caspase-3 稀釋液(1∶50)。PBS 沖洗后在37℃烘箱孵育1 h 后，PBS洗滌后滴加生物素標(biāo)記的二抗(中山金橋，羊抗兔IgG)，室溫孵育1 h。PBS 沖洗后滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min 后采用DAB顯色劑顯色。蒸餾水沖洗后，采用蘇木素復(fù)染，酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0 軟件進(jìn)行結(jié)果的處理，數(shù)據(jù)以±s 表示，神經(jīng)功能評分采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，其余多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 一般情況和神經(jīng)功能評分 本研究共使用大鼠68 只，死亡8 只，假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)死亡，其中模型組死亡5 只，參附注射液治療組3 只，兩組死亡率無明顯差異，每組大鼠數(shù)量隨機(jī)補(bǔ)齊。假手術(shù)大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能評分缺損，與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分顯著增加(4.05 ±0.19);參附注射液治療組的神經(jīng)功能評分顯著降低(2.82 ±0.09)，兩組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

圖1 各組中Nrf2 蛋白的表達(dá)量Fig.1 Expression of Nrf2 in each group

表1 各組中Nrf2、HO-1、NQO1 和cleaved-caspase-3 表達(dá)量及尼氏染色結(jié)果Tab.1 Analysis of Nrf2，HO-1，NQO1 and cleaved-caspase-3 expression and Nissl staining in each group

圖2 各組中HO-1，NQO1 和cleaved-caspase-3 的表達(dá)Fig.2 Expression of HO-1，NQO1 and cleaved-caspase-3 in each group

2.2 參附注射液對于Nrf2、HO-1 和NQO1 表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比(圖1，2;表1)，缺血再灌注組腦組織中Nrf2、HO-1 和NQO1 蛋白的表達(dá)明顯增加(P＜0.05);與缺血再灌注組大鼠相比，參附注射液治療可以進(jìn)一步增加Nrf2，HO-1 和NQO1 蛋白的表達(dá)(圖1，2;表1，P＜0.05)。此外，參附注射液可以抑制腦缺血再灌注引起的cleaved-caspase-3 蛋白的表達(dá)(圖2;表1，P＜0.05)，這個(gè)結(jié)果在免疫組化染色中得到進(jìn)一步的印證(圖3)。

2.3 尼氏染色結(jié)果 尼氏染色結(jié)果顯示，在假手術(shù)組中神經(jīng)元大而圓，細(xì)胞形態(tài)完好;腦缺血再灌注組中，出現(xiàn)大量固縮的神經(jīng)元，完整無損傷的神經(jīng)元個(gè)數(shù)顯著減少(圖3，表1，P＜0.05);參附注射液治療組中，固縮神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，完整神經(jīng)元較腦缺血再灌注組顯著增加(圖3，P＜0.05)。

3 討論

在生理狀態(tài)下，Nrf2 主要與細(xì)胞質(zhì)接頭蛋白Keap1 結(jié)合形成復(fù)合體存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到親電試劑或者ROS 刺激時(shí)，Nrf2 發(fā)生磷酸化并與Keap1 蛋白發(fā)生解偶聯(lián)，脫離Keap1 蛋白束縛的蛋白質(zhì)從胞漿中轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi)，與基因啟動(dòng)子區(qū)域中的抗氧化反應(yīng)元件序列結(jié)合，并啟動(dòng)抗氧化酶、蛋白酶體和泛素酶的基因表達(dá)，顯著提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。以往研究發(fā)現(xiàn)Nrf2 在腦缺血再灌注損傷模型中的表達(dá)量在2 h 增加至8 h 達(dá)到高峰［8］，給予Nrf2 的激活劑叔丁基對苯二酚可以顯著減少缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡和梗死面積，顯著改善神經(jīng)功能評分［9］;而敲除Nrf2 基因的小鼠在腦缺血再灌注后其梗死面積明顯增加，神經(jīng)功能缺損明顯加重;此外，研究還發(fā)現(xiàn)上調(diào)Nrf2 表達(dá)的藥物可以顯著減少神經(jīng)元的損傷［10-12］，顯著改善神經(jīng)功能的預(yù)后，提示上調(diào)Nrf2 信號通路的活性可以顯著改善腦缺血再灌注損傷的預(yù)后。

圖3 各組大鼠腦組織中cleaved-caspase-3 的免疫組化染色(上圖)和尼氏染色(下圖)結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical analysis and Nissl staining of cleaved-caspase-3 in each group

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參附注射液治療可以顯著改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評分，明顯減少受損神經(jīng)元的個(gè)數(shù)，這與以往的研究具有一致性［13］，表明參附注射液具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步行機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Nrf2 蛋白的表達(dá)量在傷后24 h 顯著升高;此外，參附注射液可以進(jìn)一步上調(diào)Nrf2 下游蛋白HO1 和NQO1 的表達(dá)量，這可能是其發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制。Cleaved-caspase-3 是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，以往大量研究表明cleavedcaspase-3 蛋白的表達(dá)量在腦缺血再灌注的腦組織中增加，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，抑制cleavedcaspase-3 蛋白的表達(dá)量可以顯著減少腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元凋亡;在腦缺血再灌注模型中，Nrf2激活后可以顯著抑制cleaved-caspase-3 蛋白的表達(dá)，減少神經(jīng)元的損害［14］;本研究結(jié)果表明參附注射液可以顯著抑制凋亡關(guān)鍵執(zhí)行蛋白cleavedcaspase-3 的表達(dá)量，從而減少神經(jīng)元的損傷程度，改善神經(jīng)功能缺損評分。結(jié)合以往研究結(jié)果，提示參附注射液可能通過上調(diào)Nrf2 信號通路的活性在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。綜上所述，參附注射液治療可以顯著上調(diào)腦缺血再灌注后Nrf2 蛋白的表達(dá)，并調(diào)節(jié)下游一系列產(chǎn)物的表達(dá)，這可能是參附注射液發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

［1］劉 敏，方向華.腦卒中后殘疾的研究進(jìn)展［J］.中華流行病學(xué)雜志，2013，34(11):1146-1150.

［2］江承平，劉 福，李 毅，等.腦缺血再灌注損傷模型大鼠參附注射液干預(yù)后熱休克蛋白70 的表達(dá)［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(41):7661-7664.

［3］江承平，劉 福，李 毅，等.參附注射液對腦缺血再灌注大鼠MDA、SOD、TXB2 及6-keto-PGF1a 的影響及意義［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41(2):124-127.

［4］Zhang M，An C，Gao Y，et al.Emerging roles of Nrf2 and phase II antioxidant enzymes in neuroprotection［J］.Prog Neurobiol，2013，100:30-47.

［5］Varshosaz J，Taymouri S，Pardakhty A，et al.Niosomes of ascorbic acid and alpha-tocopherol in the cerebral ischemia-reperfusion Model in male rats［J］.Biomed Res Int，2014，2014:816103.

［6］Yan C，Zhang J，Wang S，et al.Neuroprotective effects of rutaecarpine on cerebral ischemia reperfusion injury［J］.Neural Regen Res，2013，8(22):2030-2038.

［7］Zhuang Z，Zhou ML，You WC，et al.Hydrogen-rich saline alleviates early brain injury via reducing oxidative stress and brain edema following experimental subarachnoid hemorrhage in rabbits［J］.BMC Neurosci，2012，13:47.

［8］Tanaka N，Ikeda Y，Ohta Y，et al.Expression of Keap1-Nrf2 system and antioxidative proteins in mouse brain after transient middle cerebral artery occlusion［J］.Brain Res，2011，1370:246-253.

［9］Kam KY，Yu SJ，Jeong N，et al.p-Hydroxybenzyl alcohol prevents brain injury and behavioral impairment by activating Nrf2，PDI，and neurotrophic factor genes in a rat model of brain ischemia［J］.Mol Cells，2011，31(3):209-215.

［10］Li M，Zhang X，Cui L，et al.The neuroprotection of oxymatrine in cerebral ischemia/reperfusion is related to nuclear factor erythroid 2-related factor 2(nrf2)-mediated antioxidant response:role of nrf2 and hemeoxygenase-1 expression［J］.Biol Pharm Bull，2011，34(5):595-601.

［11］Ding Y，Chen M，Wang M，et al.Neuroprotection by acetyl-11-keto-beta-Boswellic acid，in ischemic brain injury involves the Nrf2/HO-1 defense pathway［J］.Sci Rep，2014，4:7002.

［12］Ding Y，Chen M，Wang M，et al.Posttreatment with 11-Keto-beta-Boswellic acid ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury:Nrf2/HO-1 pathway as a potential mechanism［J］.Mol Neurobiol，2014，10.1007/s12035-014-8929-9.

［13］江承平，劉 福，李 毅，等.參附注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷后MMP-9 和TIMP-1 表達(dá)的影響［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012，11(1):20-23.

［14］Li M，Zhang X，Cui L，et al.The neuroprotection of oxymatrine in cerebral ischemia/reperfusion is related to nuclear factor erythroid 2-related factor 2(nrf2)-mediated antioxidant response:role of nrf2 and hemeoxygenase-1 expression［J］.Biol Pharm Bull，2011，34(5):595-601.