結(jié)腸癌組織VEGF 表達(dá)與樹突狀細(xì)胞浸潤的臨床意義及與血清VEGF濃度及其活化水平的相關(guān)性

張子杰 (河南省南陽市中心醫(yī)院病理科，南陽 473009)

結(jié)腸癌是消化道中最常見的惡性腫瘤之一，近 年來，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年上升，目前已居于惡性腫瘤發(fā)病率的第二位［1］。腫瘤血管的形成是腫瘤發(fā)生中的必要條件，在腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移方面都起著不可替代的作用。而腫瘤血管的新生是一個十分復(fù)雜的過程，受到多種因子調(diào)控，其中功能最強(qiáng)、特異性最高的是血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，它能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和血管構(gòu)建、遷移，增加血管通透性［2］。除決定腫瘤血管生成外，VEGF 還具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠降低機(jī)體內(nèi)的免疫監(jiān)視功能，從而促進(jìn)免疫逃逸［3，4］。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)在誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)、維持機(jī)體抗腫瘤免疫中起核心作用，是目前已知的體內(nèi)唯一能激活且功能最強(qiáng)的初始T 細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞［5］。有研究表明，腫瘤組織中浸潤的DCs 存在成熟障礙，會導(dǎo)致機(jī)體無法進(jìn)行有效的免疫反應(yīng)［6］。已有報道表明［7］，結(jié)直腸癌患者外周血DCs 在腫瘤抗原刺激下誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-10 而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，DCs 數(shù)量和功能異常在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。本課題通過分析結(jié)腸癌組織中VEGF 的表達(dá)水平及血清VEGF 濃度與樹突狀細(xì)胞浸潤及其活性的相關(guān)性，揭示VEGF 與DCs 在結(jié)腸癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 2011 年1 月～2013 年12 月經(jīng)我院經(jīng)病理學(xué)確診接受結(jié)腸癌根治術(shù)的90 例結(jié)腸癌患者納入本次研究。所有結(jié)腸癌患者術(shù)前均無接受過放療、化療，并且無長期接受非甾體消炎藥、糖皮質(zhì)激素類藥以及其他影響患者免疫功能的藥物。90例結(jié)腸癌患者中，男性59 例(65.56%)、女性31 例(34.44%);年齡范圍26～83 歲，平均年齡(52.73±12.40)歲。所有病理標(biāo)本切除后測量最大直徑，在腫瘤中心取標(biāo)本進(jìn)行HE 染色，明確浸潤程度、分化程度和病理分期。取腫瘤組織外2cm 癌旁組織作為對照，并經(jīng)過病理檢查排除累及腫瘤。90 例結(jié)腸癌患者，腫瘤TNM 分期Ⅰ期13 例(14.44%)、Ⅱ期15 例(16.67)、Ⅲ期35 例(38.89%)、Ⅳ期27 例(30.00%);黏膜下層浸潤37 例(41.11%)、黏膜層浸潤53 例(58.89%);左半結(jié)腸52 例(57.78%)，右半結(jié)腸38 例(42.22%);高度分化20 例(22.22%)、中度分化23 例(25.56%)和低度分化47 例(52.22%);無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49 例(54.44%)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41 例(45.56%)。隨機(jī)選取30 例結(jié)腸癌患者術(shù)前抽取空腹肘靜脈血，其中男性21 例(70.00%)，女性9 例(30.00%)，年齡范圍27～78歲，平均年齡(52.26±11.73)歲，另選擇同期行健康體檢受試者30 例作為對照，其中男性20 例(66.67%)、女性10 例(33.33%)，年齡范圍25～80，平均年齡為(51.64±13.27)歲。本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并且所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人單克隆抗體VEGF、兔抗人S-100 多克隆抗體、ABC 試劑、DAB 試劑盒，均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供;人VEGF ELISA 檢測試劑盒，由深圳達(dá)科為公司提供;FITC-CD83，由美國BD 公司提供;外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)，由挪威Axis-shield 公司提供。EXL808 全自動酶標(biāo)儀，由美國BIO-TEK 公司提供;FACS Calibur cytometer 和Cell Quest 軟件，均由美國BD Biosciences 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法測定組織中VEGF 及S-100 蛋白的表達(dá) 采用免疫組化Envision 兩步法。使用10% 甲醛溶液固定標(biāo)本后，經(jīng)脫水和石蠟包埋處理。4 μm 連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟和梯度酒精水化后，使用pH 8.0 的EDTA 在95℃～99℃下水浴抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，使用2%山羊血清在室溫條件下封閉30 min，滴加VEGF 或S-100 一抗后4℃過夜，PBS 洗滌，加生物素二抗工作液37℃孵育30 min，滴加ABC 試劑，PBS 洗滌，DAB 顯色，使用蘇木精復(fù)染后，常規(guī)梯度乙醇脫水，使用二甲苯做透明處理后，用中性樹膠封片。陰性對照選擇PBS，陽性對照選擇已知的VEGF 或S-100 陽性切片，分別以VEGF和S-蛋白染色結(jié)果評分表示VEGF 的表達(dá)強(qiáng)度和DCs 的浸潤程度。以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為VEGF 或DCs 陽性，以陽性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度計分評判染色結(jié)果，染色結(jié)果評分為陽性染色細(xì)胞計數(shù)評分和染色強(qiáng)度評分之積，陰性(-)評分＜1 分，弱陽性(+)2～3 分，中度陽性(++)4～5 分，強(qiáng)陽性(+++)＞5 分。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清VEGF 濃度外周血VEGF 水平的測定，采用雙抗夾心ELISA 法，嚴(yán)格按試劑盒所提供的說明進(jìn)行操作。主要步驟:加抗體包被，4℃過夜，洗滌，拋干;加待檢抗原，37℃30 min，洗滌，拋干;加酶標(biāo)抗體，37℃30 min，洗滌，拋干;加底物液，37℃15 min，加終止液;用ELISA檢測儀測定OD 值。各檢測孔內(nèi)VEGF 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算。

1.3.3 DCs 活化水平的測定 外周血單核細(xì)胞利用Ficoll 分離，離心收集上清液，凍存于-70℃冰箱中備用。將單核細(xì)胞復(fù)蘇，調(diào)整細(xì)胞密度為5 ×106個/ml，將細(xì)胞鋪于24 孔板中于37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)第5 天加入TNF-α 促進(jìn)DCs 成熟。收集收獲的DCs，加入FITC-CD83，4℃孵育30 min，PBS洗滌，多聚甲醛固定，采用FACS Calibur cytometer 對獲得DCs 中成熟DC 進(jìn)行計數(shù)，以流量200 μl 為限，對照調(diào)零后檢測CD83 細(xì)胞含量，并推算原細(xì)胞懸液中CD83 DC 總量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS13.0。計量資料以±s 表示，采用獨立樣本t 檢驗進(jìn)行兩組間的比較，采用ANOVA 分析進(jìn)行多組間比較;計數(shù)資料采用χ2檢驗，以百分率表示，等級資料采用秩和檢驗;相關(guān)性采用Spearman 等級相關(guān)分析。P＜0.05 在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織VEGF 和S-100蛋白陽性表達(dá)率的比較 結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌旁組織VEGF 和S-100 蛋白陽性表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，具體見表1。結(jié)腸癌組織VEGF 陽性表達(dá)率分別為47.78%(43/90)，較結(jié)腸癌旁組織顯著提高(χ2值=47.232，P=0.000)。結(jié)腸癌組織S-100 蛋白陽性表達(dá)率為47.78%(43/90)，較結(jié)腸癌旁組織顯著降低(χ2=3.895，P=0.048)。

2.2 結(jié)腸癌患者和健康受試者外周血VEGF 水平和DCs 活化水平的比較 結(jié)腸癌患者外周血VEGF水平較健康受試者顯著升高，而外周血DCs 中CD83 水平較健康受試者顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，具體見表2。

2.3 VEGF 和S-100 蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)與臨床病理關(guān)系的單因素分析 VEGF 和S-100 蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系見表3。VEGF 和S-100 蛋白的表達(dá)與患者年齡、性別、浸潤程度和腫瘤位置不相關(guān)(P ＞0.05)，但是與腫瘤分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＜0.01)。

2.4 結(jié)腸癌組織VEGF 和DCs 浸潤程度的相關(guān)性分析 相關(guān)分析結(jié)果顯示(見表4)，VEGF 表達(dá)強(qiáng)度與DCs 浸潤程度呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.445，P=0.008)。

2.5 結(jié)腸癌組織VEGF 表達(dá)與外周血VEGF 水平和DCs 活化水平的相關(guān)性分析 相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織VEGF 表達(dá)與外周血VEGF 正相關(guān)(rs=0.613，P=0.000)，與DCs 活化水平負(fù)相關(guān)(rs=0.426，P=0.010)。

2.6 結(jié)腸癌組織DCs 浸潤程度與外周血VEGF 水平和DCs 活化水平的相關(guān)性分析 相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織DCs 浸潤程度與外周血VEGF 負(fù)相關(guān)(rs=-0.527，P=0.006)，與DCs 活化水平正相關(guān)(rs=0.645，P=0.010)。

表1 結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織VEGF 和S-100 蛋白陽性表達(dá)率的比較Tab.1 VEGF and S-100 protein positive rate in colon cancer tissue and normal pericarcinous tissue

表2 結(jié)腸癌患者和健康受試者外周血VEGF 水平和DCs活化水平的比較Tab.2 Sera VEGF and DCs activation level in colon cancer patients and healthy subjects

表4 結(jié)腸癌組織VEGF 和DCs 浸潤程度的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation between VEGF expression and DCs infiltration in colon cancer tissues

表3 VEGF 和S-100 蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系Tab.3 Correlation between VEGF，S-100 protein expression and clinical pathological features in colon cancer

3 討論

微環(huán)境中血管形成因子VEGF 與腫瘤血管的生成密切相關(guān)。VEGF 是新生血管形成的中心調(diào)控因子，是重要的促進(jìn)血管生成因子，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，并且瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF 是腫瘤具備侵襲性的必需條件［8］。VEGF 廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，且以腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為主，表達(dá)具有一定的異質(zhì)性。VEGF 與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)特異性結(jié)合，通過旁分泌途徑刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并形成新生的血管［9］。此外，VEGF 還可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤，增強(qiáng)血管通透性，有利于腫瘤基質(zhì)的形成，以此促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的活性［10，11］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者外周血VEGF 水平較健康受試者顯著升高(P ＜0.01)，并且結(jié)腸癌組織VEGF 陽性表達(dá)率較結(jié)腸癌旁組織顯著增加(P ＜0.01)。分析結(jié)腸癌組織VEGF 陽性表達(dá)率與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)關(guān)系的結(jié)果顯示，VEGF表達(dá)與腫瘤分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＜0.01)，提示VEGF 參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

DCs 能夠啟動機(jī)體的免疫反應(yīng)，不需要其他任何刺激因子的存在，是目前已知的體內(nèi)唯一能激活的且功能最強(qiáng)的初始T 細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞。DCs具有攝取、處理和提呈抗原的能力，能活化初始T細(xì)胞和增殖記憶性T 細(xì)胞，在啟動、調(diào)控和維持T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。DCs 可通過表達(dá)抗原刺激信號和共刺激信號啟動免疫應(yīng)答［12］。髓樣細(xì)胞的不正常分化會造成DCs 功能障礙，導(dǎo)致成熟DCs 數(shù)量下降以及部分黏附分子、幼稚型樹突狀細(xì)胞(Immature dendritic cell，iDC)和不成熟髓樣細(xì)胞增加等。iDCs 有較強(qiáng)的攝取和處理抗原能力，且會誘導(dǎo)T 細(xì)胞的免疫耐受［13］，因此只有成熟型樹突狀細(xì)胞(Mature dendritic cell，mDC)將抗原提呈并激活初始CD4+和CD8+T 細(xì)胞［14］，發(fā)揮特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)［15］。多種腫瘤患者體內(nèi)存在DCs 功能障礙或iDCS 增多的現(xiàn)象，不能有效地遞呈腫瘤抗原，加之DCs 表面共刺激分子和黏附分子的低表達(dá)或不表達(dá)，使得抗腫瘤免疫的核心產(chǎn)生CD8+的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)無法有效識別、殺傷腫瘤細(xì)胞，是腫瘤免疫逃逸的主要原因［16］。S-100 蛋白是一組可溶性、低分子量、高酸性的蛋白質(zhì)，特異性表達(dá)于DCs 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，而單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)S-100，因此S-100 蛋白可作為腫瘤浸潤樹突狀細(xì)胞的特異性標(biāo)記物［17］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織S-100 蛋白陽性表達(dá)率較結(jié)腸癌旁組織顯著降低(P ＜0.05)，S-100 蛋白的表達(dá)與腫瘤分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＜0.01)，提示DCs 浸潤參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。已有研究顯示，腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞和局部浸潤的DCs 之間存在相互作用，來源于腫瘤細(xì)胞的IL-10、TGF-B、PGE2，可以誘導(dǎo)局部浸潤的DCs，使其具有免疫調(diào)節(jié)和耐受活性［18］。

DCs 在提呈抗原之前以未成熟狀態(tài)iDC 遍布全身各組織器官，一旦iDC 捕獲抗原，可迅速分化為mDC，mDC 細(xì)胞膜上組織相容性抗原Ⅱ類分子表達(dá)上調(diào)，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原T 淋巴細(xì)胞活化輔助分子表達(dá)明顯升高，并出現(xiàn)DCs 成熟標(biāo)志CD83［19］。因此，本研究采用CD83 水平作為外周血DCs 的活化水平。本研究結(jié)果顯示，而外周血DCs 中CD83水平較健康受試者顯著降低，結(jié)腸癌患者體內(nèi)DCs活化水平降低，導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和耐受活性降低。研究顯示，VEGF 可抑制DCs 細(xì)胞分化以及DCs 活性而介導(dǎo)免疫逃逸［20］。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織VEGF 表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)腸癌組織DCs 浸潤程度和外周血DCs 活化水平呈負(fù)相關(guān)(P ＜0.01)，外周血VEGF 水平與結(jié)腸癌組織DCs 浸潤程度以及外周血DCs 活化水平呈負(fù)相關(guān)(P ＜0.01)，提示VEGF可抑制DCs 的浸潤和活化。

總之，結(jié)腸癌組織VEGF 表達(dá)和DCs 浸潤可能共同參與結(jié)腸癌的進(jìn)展，并且VEGF 可抑制DCs 浸潤和活化。

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