CD4+ CD25+ Foxp3+ 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在HDCP 外周血中水平變化及其意義

張義東 王青青 (浙江省德清縣人民醫(yī)院，德清 313200)

妊娠期高血壓疾病是指血壓正常婦女在懷孕20 周后發(fā)生血壓升高、雙下肢嚴(yán)重水腫和蛋白尿等癥狀，該病是妊娠婦女的特有疾病，嚴(yán)重危及母嬰的健康，也是產(chǎn)婦和圍生兒死亡的重要原因。隨著人們對規(guī)范產(chǎn)檢的重視逐漸提高，HDCP 的發(fā)病率呈上升趨勢。HDCP 的發(fā)病機(jī)制和致病因素至今尚不清楚，故臨床上針對該病并無很好的預(yù)防措施。胚胎在子宮腔內(nèi)成功的生長發(fā)育與母體的免疫耐受有著莫大的關(guān)系，如果母體的免疫耐受發(fā)生紊亂，可引起孕婦發(fā)生自然性流產(chǎn)和HDCP 等病理性妊娠［1］。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在機(jī)體的免疫耐受中起到重要作用［2］。本文研究CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013 年1 月至2014 年8 月在我院治療的妊娠期高血壓疾病(HDCP)患者，納入標(biāo)準(zhǔn):(1)診斷符合第7 版《婦產(chǎn)科學(xué)》關(guān)于HDCP 診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)患者均為初產(chǎn)婦，無其他產(chǎn)科并發(fā)癥;(3)患者及家屬知情同意，能配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有肝腎心等重要臟器疾病;(2)結(jié)核以及血液系統(tǒng)疾病史;(3)有輸血及免疫治療史。本次研究共納入患者46 例，其中輕度子癇前期22 例，重度子癇前期24 例，同時選取同期正常孕婦25 例，三組孕婦在年齡、孕周等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 FITC 熒光標(biāo)記的抗人CD抗體、PE 標(biāo)記的抗人CD25 抗體、PE-Cy5 標(biāo)記的Foxp3 試劑盒。所有抗體均購自eBioscience 公司。

1.3 檢測方法 采用真空抗凝管抽取所有患者肘靜脈血5 ml 左右，采用淋巴細(xì)胞分離液制備外周血單個核細(xì)胞，采用PBS 洗滌后制備單細(xì)胞懸液。細(xì)胞表面染色:取150 μl 外周血單個核細(xì)胞懸液，加入2 ml PBS，1 000 r/min 離心5 min 后棄去上清，然后500 μl 的PBS 重懸將細(xì)胞稀釋到1 ×106ml-1，向其中加入10 μl 的FITC 標(biāo)記的CD4 抗體和PE 標(biāo)記的CD25 抗體，室溫避光30 min，加入2 ml 冷PBS，1 000 r/min，5 min 離心洗滌。細(xì)胞內(nèi)染色:采用1 ml 破膜劑重懸細(xì)胞，室溫避光孵育1 h 后，加入1 ml透膜緩沖液，離心洗滌2 次后重懸，加入10 μl 的PE-Cy5 標(biāo)記的Foxp3 抗體，室溫避光30 min，加入2 ml 冷PBS，1 000 r/min，5 min 離心，然后加入500 μl PBS 重懸。設(shè)置相應(yīng)的對照管。流式細(xì)胞儀［BD FACSCALIBUR;BD Bioscience(U.S.A.)］檢測。

雌三醇水平測定:抽取所有患者肘靜脈血約5 ml，采用順磁性顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定法按照游離雌三醇定量檢測試劑盒(河南美凱生物科技有限公司，規(guī)格:48 人份/盒)的說明書進(jìn)行操作測定患者外周血中游離雌三醇的水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s 表示，比較使用方差分析，兩兩比較使用LSD 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 三組一般資料比較(±s)Tab.1 Three groups general data comparison(±s)

表1 三組一般資料比較(±s)Tab.1 Three groups general data comparison(±s)

2 結(jié)果

2.1 各組外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞比例情況 重度子癇前期組CD4+CD25+T 細(xì)胞比例為(5.01±1.04)%，低于輕度子癇前期組的(7.38±1.26)%和正常組的12.59±2.48)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);輕度子癇前期組CD4+CD25+T 細(xì)胞比例明顯低于正常組(P ＜0.05)。見表2。

2.2 各組外周血CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞情況輕度子癇前期組和重度子癇前期組CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞絕對數(shù)分別為(0.96±0.11)×107和(0.63± 0.12)× 107，CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 分別為(2.58±0.93)%和(1.84±0.85)%，均低于正常組的(1.85± 0.17)× 107和(5.11±0.99)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);重度子癇前期組CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞絕對數(shù)和CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 比例均低于輕度子癇前期組(P ＜0.05)。見表3，圖1。

表2 各組外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞比例情況(±s)Tab.2 Each group peripheral blood CD4 + CD25 + T cell percentage(±s)

表2 各組外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞比例情況(±s)Tab.2 Each group peripheral blood CD4 + CD25 + T cell percentage(±s)

Note:1)with normal group comparison of P ＜0.05;2)with severe pre-eclampsia group comparison of P ＜0.05.

表3 各組外周血CD4 +CD25 + Foxp3 +T 細(xì)胞情況(±s)Tab.3 Each groups peripheral blood CD4 + CD25 +Foxp3 +T cells(±s)

表3 各組外周血CD4 +CD25 + Foxp3 +T 細(xì)胞情況(±s)Tab.3 Each groups peripheral blood CD4 + CD25 +Foxp3 +T cells(±s)

Note:1)with normal group comparison of P ＜0.05;2)with severe pre-eclampsia group comparison of P ＜0.05.

圖1 流式細(xì)胞儀分析Fig.1 Flow cytomeric analysis

表4 各組血清雌三醇情況(±s)Tab.4 Each groups serum estriol(±s)

表4 各組血清雌三醇情況(±s)Tab.4 Each groups serum estriol(±s)

Note:1)with normal group comparison of P ＜0.05;2)with severe pre-eclampsia group comparison of P ＜0.05.

2.3 各組血清雌三醇情況 輕度子癇前期組和重度子癇前期組血清雌三醇分別為(6.16±2.17)mg/L 和(3.27±1.15)mg/L，明顯低于正常組的(11.34±2.4)mg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);輕度子癇前期組血清雌三醇高于重度子癇前期組(P ＜0.05)。見表4。

3 討論

妊娠期高血壓疾病在疾病早期，患者多無任何的不適，部分孕婦可有輕微的頭痛頭暈，血壓小幅度升高;病情較重者常見的臨床癥狀為頭痛，眼暈眼花，重度高血壓和蛋白尿。HDCP 孕婦的臨床檢查措施包括孕婦特殊檢查(眼底檢查、凝血功能和心肝腎等重要臟器功能檢查)和胎兒的檢查(胎兒發(fā)育狀況，胎兒宮內(nèi)情況和臍動脈血運(yùn))，臨床上主要根據(jù)患者的病史、臨床癥狀和輔助檢查等綜合診斷該疾病。HDCP 治療的主要目的是為了避免病情進(jìn)展到重度子癇前期和子癇，盡可能降低產(chǎn)婦和新生兒死亡，提高母嬰的生命安全。HDCP 的主要治療措施包括臥床休息，硫酸鎂解痙，選擇合理降壓藥降低血壓，利尿，根據(jù)患者的具體情況進(jìn)行適度鎮(zhèn)靜，必要時可終止妊娠。

免疫耐受是胚胎成功生長發(fā)育的關(guān)鍵，其發(fā)生機(jī)制可能為人體內(nèi)MHCⅠ類抗原分子的缺如和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)和局部免疫抑制［3］。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)在免疫耐受中發(fā)揮重要作用，它可保證內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，抑制機(jī)體對異體物質(zhì)的排斥和影響其他T 細(xì)胞的功能。據(jù)報道，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在妊娠早期分泌逐漸增多，直至分娩后該細(xì)胞一直處于高水平［4］。本文發(fā)現(xiàn)正常孕婦組體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞水平明顯高于妊娠高血壓孕婦，重度子癇前期組較輕度子癇前期組該細(xì)胞水平明顯降低，與相關(guān)報道結(jié)果一致［5］，說明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞參與HDCP的發(fā)病。

Foxp3 是一種轉(zhuǎn)錄因子，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，調(diào)控著CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的功能。研究已證實(shí)［6］，F(xiàn)oxp3 的mRNA 和其轉(zhuǎn)錄反映的蛋白質(zhì)特異性作用于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞。正常妊娠過程中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在妊娠早期明顯增加，中期稍微減弱，分娩后明顯減少，但妊娠期高血壓疾病可引起該細(xì)胞水平下降，病情越重其含量越低，重度子癇前期該細(xì)胞含量最低。本文結(jié)果論證了上述觀點(diǎn)，說明CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞參與妊娠高血壓疾病發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)。

研究報道，采用雌激素進(jìn)行體外刺激可增加Foxp3 的表達(dá)，可促進(jìn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的增殖分裂，使其數(shù)量增多［7］。因此，人體內(nèi)雌激素的水平對妊娠結(jié)局具有重要影響，它對妊娠過程中的免疫耐受也具有重要的作用。妊娠期間T 淋巴細(xì)胞發(fā)生明顯偏移，雌三醇可抑制該過程的發(fā)生，并促使T 淋巴細(xì)胞分化為Th2 型淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的活性，促進(jìn)其功能［8］。本文重癥子癇輕度子癇前期組和重度子癇前期組CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞絕對數(shù)量和血清雌三醇濃度均明顯低于正常妊娠組，說明CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞數(shù)量減少和雌三醇低水平無法維持機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)，可能造成病理性妊娠，如妊娠期高血壓疾病。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及相關(guān)的細(xì)胞因子在機(jī)體免疫系統(tǒng)中占有舉足輕重的地位，它們的主要功能是抑制機(jī)體的免疫活性，抑制機(jī)體對移植物的排斥作用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞對自身免疫性疾病的治療具有廣闊的應(yīng)用前景［9］。已有研究證實(shí)，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞用于自發(fā)性流產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)研究，具有很好的調(diào)節(jié)作用［10］。

總而言之，妊娠高血壓疾病患者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞明顯減少，同時血清雌三醇也有所降低，這些可能與妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制以及免疫耐受有關(guān)。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在妊娠高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步研究妊娠高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治提供理論依據(jù)。

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