細(xì)胞治療與AIDS功能性治愈

史繼靜，張　昕，徐若男，王福生

·論著·

細(xì)胞治療與AIDS功能性治愈

史繼靜，張昕，徐若男，王福生

HIV可與被感染細(xì)胞的基因組整合形成潛伏感染，進(jìn)而構(gòu)成機(jī)體的病毒儲(chǔ)存庫(kù)，后者是聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法無(wú)法徹底清除病毒、治愈AIDS的根源，探索有效的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)AIDS的功能性治愈是目前AIDS研究的熱點(diǎn)?！鞍亓植∪恕敝匦露x了HIV感染治療的結(jié)局，燃起了人類治愈AIDS的希望和信心。目前，以干細(xì)胞、T細(xì)胞等為主的細(xì)胞治療策略被認(rèn)為是治愈HIV感染的主要策略之一。本文就近年來(lái)細(xì)胞治療在AIDS功能性治愈中的研究進(jìn)行概述。

獲得性免疫缺陷綜合征；HIV；治療結(jié)果

自1981年首次從美國(guó)同性戀患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)HIV以來(lái)，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，截至2014年全世界HIV感染者已超過(guò)3500萬(wàn)［1］，嚴(yán)重威脅人類身體健康。聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法（combination antiretroviral therapy，cART）的問(wèn)世帶來(lái)AIDS治療史上的革命性進(jìn)展，但由于患者體內(nèi)病毒儲(chǔ)存庫(kù)持續(xù)存在，導(dǎo)致cART無(wú)法徹底治愈HIV感染，尋求有效策略徹底清除病毒成為亟待解決的問(wèn)題。“柏林病人”的出現(xiàn)給人類攻克AIDS燃起希望和曙光［2-3］，免疫策略尤其是以干細(xì)胞為主的細(xì)胞療法成為研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一。本文就HIV潛伏持續(xù)存在的機(jī)制及細(xì)胞治療在實(shí)現(xiàn)AIDS功能性治愈中的作用討論如下。

1　HIV儲(chǔ)存庫(kù)與功能性治愈

1.1HIV潛伏感染的形成HIV與宿主基因組整合后可中止轉(zhuǎn)錄、翻譯等生命過(guò)程，與靶細(xì)胞共同維持靜息狀態(tài)形成潛伏感染，進(jìn)而在機(jī)體內(nèi)構(gòu)成穩(wěn)定的前病毒儲(chǔ)存庫(kù)，成為AIDS無(wú)法徹底治愈的根源，一旦宿主細(xì)胞被活化或cART中斷即可產(chǎn)生具有感染力的病毒，導(dǎo)致停藥后幾乎全部復(fù)發(fā)。早在1995年，首次證實(shí)HIV感染者體內(nèi)存在潛伏感染形成的HIV儲(chǔ)存庫(kù)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其在急性感染早期大概感染后幾天內(nèi)即可形成，在接受cART的患者體內(nèi)亦可持續(xù)存在［4-5］，隨后其特點(diǎn)及形成機(jī)制被逐步揭示。

Chomont等［6］發(fā)現(xiàn)大部分的病毒儲(chǔ)存庫(kù)存在于中樞記憶性和過(guò)渡記憶性CD4+T淋巴細(xì)胞，且二者相對(duì)比例與患者體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)。記憶性CD4+T淋巴細(xì)胞較長(zhǎng)的半衰期決定了HIV儲(chǔ)存庫(kù)的長(zhǎng)期存在，理論上需要73年才能徹底清除［4］。隨后發(fā)現(xiàn)純真CD4+T淋巴細(xì)胞、Tfh細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、造血干細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等亦是HIV潛伏感染的靶細(xì)胞［6-8］。同時(shí)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸道相關(guān)淋巴組織等藥物赦免位置或藥物代謝尚不明確部位亦潛存病毒。新近發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞濾泡可作為猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）的庇護(hù)所，允許SIV感染猴子精英控制者體內(nèi)病毒持續(xù)產(chǎn)生［9］。

對(duì)HIV潛伏感染形成機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其在分子水平上主要受病毒cDNA整合位點(diǎn)、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的可用性、病毒基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控以及HIV-1轉(zhuǎn)錄狀態(tài)對(duì)細(xì)胞核拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的依賴等因素影響［10］。同時(shí)，從免疫學(xué)機(jī)制上分析，機(jī)體HIV特異性免疫無(wú)法識(shí)別和清除被感染細(xì)胞亦是導(dǎo)致HIV潛伏庫(kù)持續(xù)存在的重要因素［8］。

1.2AIDS功能性治愈目前，AIDS的治愈標(biāo)準(zhǔn)分為徹底治愈和功能性治愈。前者指從體內(nèi)徹底清除病毒；后者與前者不同，體內(nèi)病毒并未完全清除，但在停用cART后，體內(nèi)病毒仍控制在檢測(cè)限以下，且CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能維持正常，臨床無(wú)免疫缺陷和疾病進(jìn)展的表現(xiàn)。由于HIV儲(chǔ)存庫(kù)的存在以及病毒的高變異性，實(shí)現(xiàn)AIDS徹底治愈困難重重，功能性治愈被認(rèn)為是最有可能達(dá)到的目標(biāo)［11］。

繼2011年Dieffenbach和Fauci［12］提出HIV功能性治愈的概念后，Lampton［13］在2013年首次報(bào)道1例功能性治愈嬰兒，即“密西西比嬰兒”。不幸的是，2014年7月，美國(guó)專家宣布時(shí)隔12個(gè)月后在該患兒體內(nèi)再次檢測(cè)出病毒，說(shuō)明病毒庫(kù)在體內(nèi)伴隨感染之時(shí)便已建立。該患兒的治療雖然最終未能達(dá)到功能性治愈，但仍為嬰幼兒患者可能通過(guò)早期高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法（highly active antiretroviral therapy，HAART）控制病毒的進(jìn)一步復(fù)制及病毒儲(chǔ)存庫(kù)的建立，而達(dá)到AIDS功能性治愈提供了思路。

除著名的“柏林病人”外，目前在二類患者身上實(shí)現(xiàn)了功能性治愈。一類是僅占HIV感染者1%的精英控制者，此類患者體內(nèi)依然存在具有復(fù)制能力的病毒和較低水平的病毒潛伏庫(kù)，但在不進(jìn)行HAART的情況下，機(jī)體可自發(fā)有效地控制病毒至檢測(cè)限以下。對(duì)其機(jī)制進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與此類患者具有保護(hù)性的人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）等位基因如HILA-B*27、B*57和B*5801有關(guān)，這些等位基因被認(rèn)為可呈遞保守的免疫顯性表位，激發(fā)較強(qiáng)的HIV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，從而有效控制體內(nèi)潛伏病毒［14］。另一類是急性感染早期即開始HAART的患者，此類患者不具備精英控制者的HLA保護(hù)性等位基因，體內(nèi)亦缺乏較強(qiáng)的HIV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，但在中斷治療數(shù)年后病毒仍可較好地被控制在檢測(cè)限以下。進(jìn)一步隨訪分析發(fā)現(xiàn)，與大多數(shù)慢性感染階段才開始抗病毒治療的患者相比，此類患者中斷治療后體內(nèi)長(zhǎng)期存活的靜息CD4+T淋巴細(xì)胞在總的病毒儲(chǔ)存庫(kù)中僅占較小比例，表明早期抗病毒治療可顯著降低長(zhǎng)期存活記憶細(xì)胞中病毒儲(chǔ)存庫(kù)的形成［15］。同時(shí)，亦有學(xué)者報(bào)道HAART在感染早期啟動(dòng)后，一旦中斷，多數(shù)患者將出現(xiàn)病毒反彈［16］。因此，須進(jìn)一步優(yōu)化抗HIV感染的治療方案，尋找最佳的治療時(shí)機(jī)和策略來(lái)實(shí)現(xiàn)AIDS功能性治愈。

2　細(xì)胞治療在實(shí)現(xiàn)AIDS功能性治愈中的探索

實(shí)現(xiàn)AIDS功能性治愈不僅須要抑制血漿病毒復(fù)制，同時(shí)須要最大限度地減少病毒庫(kù)，并控制潛伏或殘留病毒的復(fù)制，避免停藥后復(fù)發(fā)。目前的HAART藥物雖然能使患者血漿中的病毒載量大幅度下降，甚至達(dá)到檢測(cè)不出的水平，但是藥物對(duì)潛伏的病毒，尤其是潛伏在靜止淋巴細(xì)胞內(nèi)的病毒無(wú)能為力，不能從宿主細(xì)胞中移走病毒的遺傳物質(zhì)；一旦停藥，潛伏病毒會(huì)在體內(nèi)重新繁殖，導(dǎo)致疾病再燃，因而無(wú)法徹底治愈［17］。

近年來(lái)，隨著AIDS功能性治愈研究的增多和深入，出現(xiàn)很多有前景的方法，部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。因罹患白血病接受2次造血干細(xì)胞移植（植入的干細(xì)胞攜帶對(duì)HIV入侵具有抵抗力的CCR5突變的純合子基因——CCR5Δ32/Δ32）而實(shí)現(xiàn)AIDS治愈的“柏林病人”的出現(xiàn)，使細(xì)胞治療在控制病毒復(fù)制中的作用受到密切關(guān)注，并開展了廣泛探索。

2.1未進(jìn)行基因修飾的免疫細(xì)胞治療著名的“波士頓病人”因發(fā)生惡性淋巴瘤而進(jìn)行造血干細(xì)胞移植，與“柏林病人”不同，植入的干細(xì)胞是CCR5野生型，對(duì)HIV入侵不具有抵抗力，移植后停止HAART曾一度檢測(cè)不到病毒，提示造血干細(xì)胞移植過(guò)程中發(fā)生的嵌合效應(yīng)或移植物抗宿主反應(yīng)在HIV清除中起重要作用，但數(shù)月后病毒反彈而不得不繼續(xù)抗病毒治療。這2例“波士頓病人”未實(shí)現(xiàn)功能性治愈，但像“柏林病人”一樣，鼓舞了科學(xué)家利用干細(xì)胞手段治愈HIV感染的信心［18］。隨后，另有2例并發(fā)惡性腫瘤的HIV感染者植入攜帶CCR5Δ32/Δ32的成人干細(xì)胞，但于4個(gè)月后因感染而死亡［19］。

“柏林病人”治愈的關(guān)鍵在于植入了攜帶對(duì)HIV感染具有抵抗力的純合子基因CCR5Δ32/Δ32的供體造血干細(xì)胞，但是攜帶該類基因的個(gè)體很少，在北歐人群中僅占0.8%～1.0%，其他種族更少［1］。同時(shí)造血干細(xì)胞移植需要嚴(yán)格的HLA配型，大部分HIV感染者不可能重現(xiàn)“柏林病人”的成功，因此有學(xué)者報(bào)道采用CCR5Δ32/Δ32的臍血干細(xì)胞移植治療HIV感染，并有望成為目前治療HIV感染最可行的方法［20］。Duarte等［21］采用CCR5Δ32/Δ32臍血干細(xì)胞移植治療1例并發(fā)B細(xì)胞淋巴瘤的HIV感染者，先后進(jìn)行2次移植。第1次移植后第7周嵌合率＜5%，第52天又進(jìn)行第2次移植并取得成功，第73天檢測(cè)嵌合率為100%，至此患者的造血細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞均轉(zhuǎn)變?yōu)镃CR5Δ32/Δ32突變型。對(duì)其血漿病毒載量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)移植后快速下降，到完全嵌合時(shí)達(dá)到最低，且檢測(cè)不到HIV DNA。遺憾的是，移植后3個(gè)月患者因淋巴瘤病情惡化而死亡。

除造血干細(xì)胞和臍血干細(xì)胞外，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞亦被用于HIV感染的治療。王福生團(tuán)隊(duì)用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療經(jīng)HAART免疫重建失敗的HIV感染者，發(fā)現(xiàn)該方法可顯著增加患者CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，降低免疫系統(tǒng)超活化，為用于細(xì)胞治療的細(xì)胞種類的選擇提供了一種參考［22］。

2.2基因修飾的免疫細(xì)胞治療鑒于CCR5Δ32/ Δ32突變體的稀缺，通過(guò)基因改造技術(shù)制造CCR5表達(dá)缺陷的免疫細(xì)胞（通常為干細(xì)胞和T細(xì)胞），從而使HIV無(wú)法侵入免疫系統(tǒng)，重現(xiàn)“柏林病人”的成功，成為AIDS功能性治愈研究的熱點(diǎn)。自20世紀(jì)90年代晚期開始，已有不少科學(xué)家進(jìn)行基因修飾細(xì)胞用于HIV感染治療安全性、可行性和有效性的探索?？笻IV的核酸酶、反義轉(zhuǎn)錄、RNA誘餌等技術(shù)被廣泛應(yīng)用。

Tebas等［23］在體外運(yùn)用鋅指核酸酶技術(shù)敲除患者CD4+T淋巴細(xì)胞的CCR5基因，擴(kuò)增培養(yǎng)后回輸患者體內(nèi)，經(jīng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)證實(shí)是安全可行的。在經(jīng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)OZI（一種反轉(zhuǎn)錄載體，攜帶抗病毒RNA編碼蛋白Tat和Vpr的核酸酶基因）的T細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞回輸療法安全和有效的基礎(chǔ)上，美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校完成了第1個(gè)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的干細(xì)胞基因療法Ⅱ期臨床試驗(yàn)，共入組74例患者。動(dòng)員患者的CD34+造血前體細(xì)胞（hematopoietic progenitor and stem cells，HPSCs）轉(zhuǎn)導(dǎo)OZI后重新輸入患者體內(nèi)。回輸后47～48周2組患者血漿病毒載量無(wú)明顯差異，40～100周治療組病毒載量明顯下降，且至100周時(shí)體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著增加。這一研究首次證實(shí)了經(jīng)基因修飾的HPSCs輸入患者體內(nèi)的安全性和有效性［24］。Wolstein等［25］利用慢病毒載體LVsh5/c46（同時(shí)編碼下調(diào)CCR5表達(dá)的發(fā)夾RNA 和HIV融合抑制劑c46）轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+HPSCs和T細(xì)胞，進(jìn)行了臨床前安全性和有效性實(shí)驗(yàn)，目前正在進(jìn)行Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT01734850），同時(shí)這也是第1個(gè)用RNAi聯(lián)合C46抑制劑進(jìn)行免疫細(xì)胞基因修飾治療HIV感染的臨床試驗(yàn)。

嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）是當(dāng)前過(guò)繼性細(xì)胞治療技術(shù)中的最新技術(shù)之一，實(shí)現(xiàn)了從基礎(chǔ)免疫學(xué)機(jī)制研究到臨床免疫治療應(yīng)用的轉(zhuǎn)變。早在20年前科學(xué)家們已嘗試將CAR-T用于HIV感染治療中，Scholler等［26］對(duì)1998—2005年3項(xiàng)臨床試驗(yàn)（Mitsuyasu、Deeks和Aronson試驗(yàn)）的患者隨訪發(fā)現(xiàn)，表達(dá)CD4ζ CAR的自體CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞在HIV感染者體內(nèi)可穩(wěn)定存活至少11年，顯示出CAR-T在HIV感染細(xì)胞治療領(lǐng)域的強(qiáng)大潛力。HIV Env特異性地表達(dá)CD4-CD3ζ嵌合受體的T細(xì)胞在體外試驗(yàn)中可有效殺死HIV感染細(xì)胞或表達(dá)HIV Env蛋白的細(xì)胞，但這種第1代CAR-T在隨后的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)中并未獲得成功。Sahu等［27］設(shè)計(jì)出的第2代CAR-T（命名為CD4-CD28-CD3ζ）不僅可殺死表達(dá)HIV Env蛋白的細(xì)胞，且在細(xì)胞系模型上證實(shí)可以激活潛存的HIV并將其清除，為尋求有效策略實(shí)現(xiàn)AIDS功能性治愈甚至徹底治愈提供了參考。造血干細(xì)胞具有分化為多種免疫細(xì)胞的能力，因此與CD4+T淋巴細(xì)胞相比，基因修飾的造血干細(xì)胞可以長(zhǎng)期提供抵抗病毒感染的免疫細(xì)胞亞群，幾乎涵蓋了已知的所有能被HIV感染的靶細(xì)胞［28］。但現(xiàn)有的臨床試驗(yàn)證實(shí)2種細(xì)胞均未獲得理想療效，體外靶基因較低的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致較多異源基因進(jìn)入靶細(xì)胞，以及植入后可檢測(cè)到的修飾細(xì)胞含量極低等可能是限制其療效的重要因素。因此，如何克服上述障礙，延長(zhǎng)修飾細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間和提高植入率是提高療效的關(guān)鍵。Ye等［29］采用TALENs或RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas9核酸酶技術(shù)與piggyBac技術(shù)聯(lián)合，設(shè)計(jì)出攜帶無(wú)殘存序列的CCR5Δ32突變體的多能干細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)于目前常用的干細(xì)胞基因改造技術(shù)，并在體外將其誘導(dǎo)分化為抗HIV感染的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

Myburgh等［30］利用RNAi技術(shù)，將敲除CCR5的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)HPSCs后植入人源化小鼠模型，移植后小鼠對(duì)CCR5-HIV病毒株有持久抵抗力，且數(shù)月后病毒載量明顯降低，人源化CD4+T淋巴細(xì)胞持續(xù)存在。表明這種基于HPSCs的CCR5敲除策略有望在體內(nèi)有效控制HIV，且人源化CD4+T淋巴細(xì)胞的持續(xù)存在克服了以往只有較少比例抗HIV細(xì)胞存在的局限性，有望持久提供抗HIV的免疫活性細(xì)胞。

病毒基因偏嗜性的改變對(duì)細(xì)胞治療療效亦有較大影響。Kordelas等［31］報(bào)道1例體內(nèi)可檢測(cè)出CXCR4-HIV RNA的患者進(jìn)行了CCR5Δ32/Δ32突變型造血干細(xì)胞移植，在清髓治療開始時(shí)停用抗病毒藥物，但移植后3周因病毒反彈而繼續(xù)cART，移植后12個(gè)月因非霍奇金淋巴瘤而死亡。對(duì)其基因型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)移植前以CCR5-HIV為主，移植后轉(zhuǎn)變?yōu)橐訡XCR4為主，但并不清楚這種共受體轉(zhuǎn)變?cè)诳共《局委熐昂蠛螘r(shí)發(fā)生。這個(gè)病例的出現(xiàn)預(yù)示病毒偏嗜性變異可能成為利用CCR5敲除策略控制HIV感染的重要影響因素，因此AIDS的治愈需要多途徑、多策略的有效聯(lián)合。

3　小結(jié)與展望

過(guò)去30多年，人類對(duì)抗AIDS的戰(zhàn)役經(jīng)歷了3次革命性進(jìn)展。1996年cART的問(wèn)世，無(wú)疑是第1次革命，具有劃時(shí)代意義，幾乎從根本上改變了AIDS的疾病進(jìn)展，使其由致死性疾病轉(zhuǎn)為某種程度上可控的慢性疾病。cART在高效抑制患者體內(nèi)病毒復(fù)制的同時(shí)，依然存在無(wú)法徹底恢復(fù)機(jī)體免疫功能、停藥后病毒快速反彈、耐藥菌株出現(xiàn)、長(zhǎng)期服藥伴隨的依從性較低、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)過(guò)重、精神壓力較大等問(wèn)題。這迫使人們不得不對(duì)其進(jìn)行深入研究，以尋求更佳的治療方法。長(zhǎng)期存活的病毒儲(chǔ)存庫(kù)的發(fā)現(xiàn)成為HIV感染研究里程上的第2次革命性進(jìn)展，很好解釋了cART無(wú)法徹底治愈HIV感染的原因，對(duì)今后尋求有效策略清除病毒具有重要意義。2009年“柏林病人”的出現(xiàn)給人類實(shí)現(xiàn)AIDS治愈帶來(lái)希望和曙光，迎來(lái)抗AIDS戰(zhàn)役的第3次革命。目前，針對(duì)HIV儲(chǔ)存庫(kù)的清除策略主要有早期治療、抗病毒藥物的強(qiáng)化治療、基因治療和免疫治療等。以干細(xì)胞基因修飾為主的細(xì)胞治療雖然未取得理想效果，但為人類攻克AIDS治愈難關(guān)提供了策略和參考。相信在不久的將來(lái)，細(xì)胞治療手段與其他策略的聯(lián)合應(yīng)用能夠使更多的HIV感染者實(shí)現(xiàn)功能性治愈，從而在HIV感染徹底治愈的道路上實(shí)現(xiàn)質(zhì)的突破。

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（2015-10-11收稿2015-11-14修回）

（責(zé)任編委李軍本文編輯王姝）

Cell therapy and functional cure for AIDS

SHI Ji-jing，ZHANG Xin，XU Ruo-nan，WANG Fu-sheng*Infectious Diseases Diagnosis，Treatment and Research Center，302 Military Hospital of China-Peking University Teaching Hospital，Beijing 100039，China *Corresponding author，E-mail:fswang302@163.com

HIV can integrate into the genomes of infected cells and persist in a stable latent reservoir.Viral reservoir is the obstacle to the eradication of HIV and a cure for AIDS in patients receiving combination antiretroviral therapy，so pursuing effective strategies for functional cure for AIDS is the focus of AIDS research.New treatment outcome of HIV infection--the eradication of HIV occurred in the"Berlin patient"，which brought hope and inspired the confidence to cure AIDS.Nowadays，cell therapy based on stem cells and T cells is regarded as one of the potential strategies to cure HIV infection.This article focuses on the recent findings on cell therapy in functional cure for AIDS.

acquired immunodeficiency syndrome；HIV；treatment outcome

王福生，E-mail:fswang302@163.com

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.06.003

100039，北京大學(xué)解放軍第三〇二醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心（史繼靜、王福生）；100039，解放軍第三〇二醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心（張昕、徐若男、王福生）