HIV-1病毒載量檢測(cè)常用技術(shù)及研究進(jìn)展

張　嶺，蔣　巖，潘品良

HIV-1病毒載量檢測(cè)常用技術(shù)及研究進(jìn)展

張嶺，蔣巖，潘品良

病毒載量檢測(cè)是HIV-1感染后需要長(zhǎng)期觀察的重要指標(biāo)，在基礎(chǔ)研究、早期感染的診斷、藥物治療學(xué)研究和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)方面都有特殊的意義。目前普遍使用的HIV病毒載量檢測(cè)主要是測(cè)定血漿中病毒RNA的量，采用的方法包括熒光定量PCR技術(shù)、核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)以及分支DNA雜交技術(shù)等。檢測(cè)的樣本包括血清、分泌物及全血制備的干血斑等多種類型，檢測(cè)的靶點(diǎn)也會(huì)涉及到細(xì)胞基因組中整合的病毒DNA的應(yīng)用。反轉(zhuǎn)錄酶法檢測(cè)技術(shù)和其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等許多技術(shù)已用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，一些交叉學(xué)科技術(shù)正進(jìn)行著實(shí)驗(yàn)性探索。我國(guó)已有HIV-1病毒載量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室140余家，3種經(jīng)典的檢測(cè)技術(shù)均有涉及。各種技術(shù)特點(diǎn)不同，但在病毒載量檢測(cè)工作中均發(fā)揮巨大的作用。

HIV-1；病毒載量；分支DNA信號(hào)擴(kuò)增試驗(yàn)；綜述

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2013年全球有970萬(wàn)HIV感染者接受抗病毒治療（antiretroviral therapy，ART），至2015年底預(yù)計(jì)有1500萬(wàn)感染者將接受ART［1］。參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院發(fā)布的指導(dǎo)原則，中國(guó)制訂了《艾滋病治療手冊(cè)》，規(guī)定接受治療的感染者必須定期檢測(cè)血漿中HIV-1 RNA水平（病毒載量），以反映藥物療效，預(yù)防耐藥的發(fā)生。當(dāng)接受ART后病毒載量＞200copies/ml時(shí)可認(rèn)為治療失敗，須調(diào)整治療方案［2］。

如上所述，目前病毒載量檢測(cè)的靶點(diǎn)一般為RNA，檢測(cè)試劑包括羅氏診斷的 Cobas AmpliPre/Cobas TaqMan HIV-1 Testv 2.0、雅培公司的RealTime HIV-1、梅里埃公司的NucliSens EasyQ HIV-1 v2.0及和西門子公司的Versant HIV-1 RNA 3.0 assay（b-DNA）。除此以外，Cavidi公司還開發(fā)了以反轉(zhuǎn)錄酶為靶點(diǎn)的病毒載量檢測(cè)試劑exavir load。近年國(guó)內(nèi)基于實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)與不同的核酸提取方法進(jìn)行研制，凱杰、達(dá)安基因、東北制藥、寶瑞源、珠海麗珠與萬(wàn)泰生物等企業(yè)研制開發(fā)了國(guó)內(nèi)的HIV-1病毒載量檢測(cè)試劑盒。

1　樣本類型

HIV載量檢測(cè)的待測(cè)樣本通常為血漿?？紤]到肝素是Taq酶的抑制劑，目前已上市的多個(gè)病毒載量檢測(cè)試劑在使用時(shí)應(yīng)避免用肝素抗凝，一般使用EDTA作為抗凝劑。另外，血清樣品也可用于測(cè)試，但同一患者的血清和血漿樣品同時(shí)檢測(cè)時(shí)，血清的病毒載量結(jié)果會(huì)略低于血漿樣品檢測(cè)結(jié)果。

針對(duì)HIV的性傳播特性，研究表明精液中的病毒載量與血漿病毒載量存在正相關(guān)關(guān)系，且前者略低于后者［3-4］，但也有部分感染者精液病毒載量會(huì)高于血漿，可能是受生殖道內(nèi)免疫功能的影響。而受陰道內(nèi)酸性環(huán)境的影響，HIV女性感染者陰道分泌物中的病毒含量值變化很大［5］。另外，唾液中也可檢出HIV，但數(shù)值大大低于血漿病毒載量結(jié)果。

針對(duì)全血樣品，目前應(yīng)用最多的是干血斑這種處理方式。2010年3月，WHO發(fā)布了使用干血斑樣本作為替代樣本進(jìn)行HIV耐藥檢測(cè)的操作手冊(cè)［6］。2014年，Smit等［7］總結(jié)了以往的13項(xiàng)研究，提出使用干血斑進(jìn)行病毒載量檢測(cè)時(shí)，若檢測(cè)限定為1000 copies/ml，靈敏度為78%～100%；若檢測(cè)限定為5000 copies/ml，靈敏度可提升至100%。另外，因?yàn)檠獫{病毒載量只檢測(cè)游離病毒，而干血斑檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RNA及整合入染色體的病毒前體DNA，所以還存在假陽(yáng)性問(wèn)題，影響對(duì)抗病毒治療的監(jiān)測(cè)［8］。

2010年開始，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心針對(duì)HIV病毒載量檢測(cè)推行一種實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證系統(tǒng)，它所下發(fā)的考核樣品為干血管（dried tube specimens，DTS）［9］。該樣品類型室溫條件下可穩(wěn)定8周，且沒有傳染性，所以對(duì)運(yùn)輸條件沒有嚴(yán)格要求。另外，復(fù)溶之后，現(xiàn)有的病毒載量檢測(cè)系統(tǒng)均可對(duì)該類型樣本進(jìn)行檢測(cè)。所以DTS可替代傳統(tǒng)的液態(tài)血漿標(biāo)本完成實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證工作，但由于其制備流程復(fù)雜，還不能大規(guī)模用于常規(guī)的病毒載量檢測(cè)［10］。

2　HIV-1病毒載量檢測(cè)技術(shù)

HIV-1病毒載量檢測(cè)方法有多種原理，常用的包括核酸等溫?cái)U(kuò)增、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、分支DNA技術(shù)、非核酸的酶法檢測(cè)等，另外很多交叉學(xué)科也在HIV檢測(cè)方面進(jìn)行了試驗(yàn)型探索。分別介紹如下。

2.1核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)目前核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要有4種，解旋酶依賴性擴(kuò)增［11］、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增［12］、核酸序列依賴性擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）和重組酶聚合酶擴(kuò)增［13］，均在HIV病毒載量檢測(cè)中有不同程度的應(yīng)用，其中應(yīng)用最為成熟的是NASBA技術(shù)。

1991年，Cangene公司的Compton［14］在Nature上刊文，介紹了NASBA技術(shù)。該技術(shù)可以與其他很多技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)診斷的目的。Mollasalehi和Yazdanparast［15］用納米金檢測(cè)NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得良好效果。Zhao和Dong等［16］將NASBA技術(shù)與芯片技術(shù)結(jié)合，可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣本的多個(gè)指標(biāo)。2002年，生物梅里埃公司W(wǎng)eusten等［17］將分子信標(biāo)與NASBA技術(shù)相結(jié)合，建立了實(shí)時(shí)檢測(cè)體系，并且推導(dǎo)出相應(yīng)的病毒載量計(jì)算公式，形成NucliSENS EasyQ HIV-1病毒載量檢測(cè)試劑盒。2005年，在一項(xiàng)有4個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加的多中心評(píng)價(jià)中，該試劑盒的線性、特異性和重復(fù)性與當(dāng)時(shí)已上市的病毒載量試劑盒沒有明顯區(qū)別，且對(duì)于非B亞型和O亞型檢測(cè)效果更好［18］。

由于NASBA技術(shù)為RNA擴(kuò)增，不會(huì)受基因組DNA的影響，所以在很多研究中將EasyQ試劑與干血斑采樣方式相結(jié)合，用于偏遠(yuǎn)地區(qū)的抗病毒治療監(jiān)測(cè)，取得良好效果。Mercier-Delarue等［19］發(fā)現(xiàn)，針對(duì)干血斑樣品，實(shí)時(shí)PCR方法的特異性為58/70，而NASBA技術(shù)的特異性為95/97，很明顯NASBA由于可排除染色體DNA干擾特異性更高。

2.2實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)1996年，Heid等［20］在Genome Research上發(fā)表文章，詳細(xì)說(shuō)明了TaqMan探針、實(shí)時(shí)熒光PCR以及基于此的核酸定量原理和計(jì)算公式，形成了第二代PCR技術(shù)。目前很多公司以實(shí)時(shí)熒光定量PCR為基礎(chǔ)，開發(fā)出HIV病毒載量診斷試劑。有代表性的包括羅氏公司的Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 test（CAP/CTM）以及雅培公司的m2000 real-time HIV assay。

羅氏公司的CAP/CTM 1.0試劑采用標(biāo)準(zhǔn)的TaqMan探針技術(shù)，隨著應(yīng)用越來(lái)越多，發(fā)現(xiàn)該試劑的亞型覆蓋不夠全面，另外其靈敏度較差，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果［21］。針對(duì)這些問(wèn)題羅氏公司對(duì)試劑進(jìn)行了改進(jìn)，推出CAP/CTM 2.0，在原來(lái)gag區(qū)靶基因的基礎(chǔ)上增加一段3'-UTR區(qū)序列作為靶基因，收到良好的效果。雅培公司的HIV-1 assay與羅氏公司產(chǎn)品相類似，只是其靶基因選在pol基因的整合酶片段內(nèi)。另外檢測(cè)下限也有所不同。

上述兩套系統(tǒng)均采用全自動(dòng)設(shè)備，利用磁珠吸附的原理完成核酸提取，所以設(shè)備成本高、尺寸大、運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)。而臨床需要快速簡(jiǎn)便的病毒載量檢測(cè)方法，針對(duì)這一需求，很多公司開發(fā)出以PCR為原理的POCT系統(tǒng)。例如羅氏的Cobas Liat系統(tǒng)以及Alere公司的Alere q HIV analyzer，都是將樣本核酸提取和擴(kuò)增過(guò)程集中到一塊微流樣本卡上，在特定儀器上完成擴(kuò)增后直接讀數(shù)，方便快捷。

目前，很多國(guó)內(nèi)廠家也利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開發(fā)出HIV-1病毒載量檢測(cè)試劑。已通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)認(rèn)證的HIV病毒載量檢測(cè)試劑有6個(gè)（表1）。

表1　國(guó)產(chǎn)HIV-1病毒載量檢測(cè)試劑Table 1　Domestic HIV-1 viral load testing kits

2.3分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)（branched DNA，bDNA）bDNA技術(shù)是Chiron公司開發(fā)出的檢測(cè)技術(shù)，于1993年首先用于HIV檢測(cè)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需要核酸提取過(guò)程，不需要反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增，并且對(duì)樣品要求低，溶血樣品和福爾馬林固定過(guò)的組織樣品也可以檢測(cè)。Versant HIV-1 RNA 3.0 assay是西門子公司基于bDNA原理的產(chǎn)品，由于該技術(shù)不依賴于核酸擴(kuò)增，所以受擴(kuò)增條件的影響小。體現(xiàn)在檢測(cè)結(jié)果上，低載量的樣品檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性優(yōu)于PCR方法，適用于用藥患者病毒載量的監(jiān)測(cè)。

2.4非核酸檢測(cè)技術(shù)ExaVir Load是瑞典Cavidi公司開發(fā)的HIV-1病毒載量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒不是以核酸為檢測(cè)靶點(diǎn)，而是以病毒的反轉(zhuǎn)錄酶為靶點(diǎn)，用特殊的底物檢測(cè)樣品中反轉(zhuǎn)錄酶的活性來(lái)折算病毒載量。由于不涉及核酸，所以該方法可覆蓋各種亞型，并且也不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。Huang等［22］于2010年收集了87例患者的215份樣品，對(duì)ExaVir Load第2版和第3版進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以羅氏Cobas TaqMan系統(tǒng)為參照。結(jié)果顯示ExaVir Load 第3版的檢出率為95.3%，檢測(cè)結(jié)果與羅氏結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.95。

2.5探索性的研究技術(shù)在多項(xiàng)探索性研究中，人們將分子生物學(xué)技術(shù)、生物傳感器技術(shù)及納米技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于HIV病毒檢測(cè)中。Sun等［23］將外切酶介導(dǎo)的目的片段循環(huán)技術(shù)與銀離子探針相結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)游離銀離子濃度實(shí)現(xiàn)HIV DNA的檢測(cè)。Shafiee等［24］設(shè)計(jì)了一種具有納米結(jié)構(gòu)的光子晶體，在晶體上連接特異的抗體直接捕獲生物樣本中的完整HIV-1病毒顆粒，通過(guò)反射光波長(zhǎng)的偏移檢測(cè)HIV-1病毒載量。Yan等［25］用光子點(diǎn)聚合物作為示蹤劑，以氧化鐵微球作為捕獲劑，兩者均標(biāo)記寡核苷酸鏈，與HIV DNA互補(bǔ)結(jié)合，以光子點(diǎn)的量計(jì)算病毒載量。上述方法由于還處在試驗(yàn)階段，靈敏度均在105copies/ml左右，還遠(yuǎn)沒有達(dá)到臨床要求。

3　方法學(xué)比較

不同方法因原理不同，在檢測(cè)過(guò)程中各有其特點(diǎn)。下面就國(guó)內(nèi)常用病毒載量檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性和定值進(jìn)行比較。

3.1靈敏度目前國(guó)內(nèi)常用的HIV-1病毒載量檢測(cè)試劑的檢測(cè)下限見表2。單純從檢測(cè)下限看EasyQ的靈敏度最高，bDNA的靈敏度最低，這與文獻(xiàn)報(bào)道的略有不同。2005年，de Mendoza等［18］在對(duì)EasyQ進(jìn)行試劑評(píng)價(jià)時(shí)完成了2項(xiàng)試驗(yàn)，在121例樣品的試驗(yàn)中，Amplicor的檢出率為94%，EasyQ的檢出率為91%；113例樣品的試驗(yàn)中bDNA的檢出率為51%，而EasyQ的檢出率為68%。2007年，Holguín等［26］收集了83例非B亞型或重組型HIV感染者的血漿，分別用bDNA、CAP/CTM和EasyQ測(cè)定病毒載量，評(píng)價(jià)3種試劑對(duì)低值樣品的檢測(cè)能力。結(jié)果顯示接受抗病毒治療的28例樣本3種方法結(jié)果均為陰性，而其余55例原始患者bDNA、CAP/ CTM和EasyQ檢測(cè)呈陰性的比例分別為20.0%、14.6%和32.7%。這2項(xiàng)研究中Amplicor或CAP/ CTM（反轉(zhuǎn)錄PCR方法）的靈敏度最高。

表2　不同試劑主要性能指標(biāo)Table 2　Comparison of main performance of current HIV-1 viral load testing kits

3.2特異性各種試劑均有提高其特異性的設(shè)計(jì)，例如CAP/CTM試劑采用UNG酶-dUTP系統(tǒng)，可以預(yù)防環(huán)境中之前的擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)本次檢測(cè)的影響。bDNA試劑的預(yù)雜交探針中有一部分包含非天然核苷（isoC、isoG），該部分探針可以去除非特異性結(jié)合，提高信號(hào)/噪聲比。EasyQ試劑本身就是RNA擴(kuò)增方式，可以去除血漿中殘留的DNA（如外泌體DNA）對(duì)擴(kuò)增的干擾。

3.3重復(fù)性病毒載量檢測(cè)的主要目的之一就是對(duì)接受抗病毒治療的患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)，評(píng)價(jià)藥物療效、預(yù)防耐藥發(fā)生、監(jiān)控患者病情發(fā)展。而這部分患者的血漿病毒載量一般都很低或小于檢測(cè)限，所以評(píng)價(jià)試劑對(duì)低載量樣品的檢測(cè)重復(fù)性非常有意義。普遍認(rèn)為bDNA方法檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性最好。Lubelchek等［27］比較了Amplicor和bDNA對(duì)低載量樣品的檢測(cè)能力，結(jié)果顯示Amplicor的變異系數(shù)為0.55，而bDNA的變異系數(shù)為0.19。

3.4定值本實(shí)驗(yàn)室2007年利用國(guó)內(nèi)樣品（主要為CRF_BC型）對(duì)早期的3種方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示同一樣品COBAS Amplicor Version 1.5（RTPCR，Amplicor）檢測(cè)得到的病毒載量值最高，其次為Versant HIV-1 RNA 3.0 assay（bDNA），而NucliSens HIV-1 QT（NASBA）得到的病毒載量值最低［28］。Pyne等［29］用包含9個(gè)亞型的血清盤對(duì)Cobas Ampli-Prep/Cobas TaqMan（CAP/CTM）、Amplicor以及bDNA 3種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示CAP/CTM和Amplicor的檢測(cè)結(jié)果明顯高于 bDNA。另外，在上文Holguín等［26］的工作中，EasyQ的檢測(cè)結(jié)果最高，平均為4.87 log10copies/ml，bDNA得到的結(jié)果最低，平均為4.16 log10copies/ml，相差0.7 log10copies/ml?？梢奲DNA的定值最低，推測(cè)可能的原因是bDNA體系中含有復(fù)雜的探針系統(tǒng)，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品之間探針雜交效率的微小差異會(huì)直接影響最終計(jì)算得到的病毒載量值。

4　總　結(jié)

病毒載量檢測(cè)技術(shù)主要用于解決與HIV感染有關(guān)的理論和實(shí)際問(wèn)題，包括病毒活性與病程的關(guān)系及病毒穩(wěn)態(tài)與預(yù)后的關(guān)系，在臨床試驗(yàn)中對(duì)抗病毒藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以在出現(xiàn)臨床癥狀之前開始用藥，在臨床癥狀發(fā)展之前判斷藥物治療是否失敗，評(píng)價(jià)治療方案的有效性等。

現(xiàn)在病毒載量檢測(cè)除了與抗病毒治療相結(jié)合以外，相關(guān)技術(shù)還可應(yīng)用于不確定病例的診斷，特別是窗口期患者［免疫學(xué)檢測(cè)的窗口期為（19±2）d，而核酸檢測(cè)窗口期為（10±2）d［30］］以及晚期感染者（晚期患者抗原反應(yīng)性衰減，檢測(cè)結(jié)果會(huì)呈現(xiàn)不確定型）的診斷。另外在血源篩查及高危人群的篩查方面，匯集方式的病毒載量檢測(cè)即可以縮短檢測(cè)窗口期，提高靈敏度，如果策略得當(dāng)?shù)脑掃€可以降低檢測(cè)成本。

隨著HIV病毒載量應(yīng)用的普及，檢測(cè)技術(shù)也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但總體上有以下幾個(gè)發(fā)展方向。第一，實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)成為主流，該技術(shù)由于成本低、操作簡(jiǎn)單、技術(shù)積累豐富等優(yōu)點(diǎn)，在病毒載量檢測(cè)中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。目前國(guó)內(nèi)廠家的病毒載量檢測(cè)試劑均是基于實(shí)時(shí)PCR技術(shù)開發(fā)的，其他技術(shù)例如分支DNA技術(shù)已逐步退出載量檢測(cè)領(lǐng)域。第二，檢測(cè)設(shè)備趨向于一體化，或者是大型的全自動(dòng)設(shè)備完成樣本處理和檢測(cè)，或者發(fā)展成小型的POCT產(chǎn)品，而核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于對(duì)反應(yīng)條件要求很低，最有希望開發(fā)成POCT產(chǎn)品。第三，由于抗病毒藥物的使用，多數(shù)HIV-1感染者血漿中的病毒會(huì)得到控制，表現(xiàn)為經(jīng)典的病毒載量檢測(cè)結(jié)果小于檢測(cè)下限，此時(shí)為了更好地評(píng)價(jià)治療效果，細(xì)胞基因組中整合的HIV成為研究熱點(diǎn)，它的水平高低決定著患者預(yù)后。目前不是所有試劑都可以檢測(cè)病毒DNA，相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)策略還有待完善。

［1］ WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. Consolidated Guidelines on the Use of Antiretroviral Drugs for Treating and Preventing HIV Infection:Recommendations for a Public Health Approach［M］.Switzerland:WHO Press，2013.

［2］WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. AntiretroviralTherapyforHIVInfectioninAdultsand Adolescents［M］.Switzerland:WHO Press，2010.

［3］ Stekler J，Sycks BJ，Holte S，et al.HIV dynamics in seminal plasma during primary HIV infection［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2008，24（10）:1269-1274.

［4］Hoffman JC，Anton PA，Baldwin GC，et al.Seminal plasma HIV-1 RNA concentration is strongly associated with altered levels of seminal plasma interferon-γ，interleukin-17，and interleukin-5 ［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2014，30（11）:1082-1088.

［5］Borgdorff H，Tsivtsivadze E，Verhelst R，et al.Lactobacillusdominated cervicovaginal microbiota associated with reduced HIV/ STI prevalence and genital HIV viral load in African women［J］. ISME J，2014，8（9）:1781-1793.

［6］World Health Organization.WHO manual for HIV drug resistance testing using dried blood spot specimens［M］.Switzerland:WHO Press，2010.

［7］Smit PW，Sollis KA，F(xiàn)iscus S，et al.Systematic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral load and for early infant diagnosis［J］.PLoS One，2014，9（3）:e86461.

［8］ Sawadogo S，Shiningavamwe A，Chang J，et al.Limited utility of dried-blood-and plasma spot-based screening for antiretroviral treatment failure with Cobas Ampliprep/TaqMan HIV-1 version 2.0［J］.J Clin Microbiol，2014，52（11）:3878-3883.

［9］Ramos A，Nguyen S，Garcia A，et al.Generation of dried tube specimen for HIV-1 viral load proficiency test panels:a costeffective alternative for external quality assessment programs［J］. J Virol Methods，2013，188（1-2）:1-5.

［10］Nguyen S，Ramos A，Chang J，et al.Monitoring the quality of HIV-1 viral load testing through a proficiency testing program using dried tube specimens in resource-limited settings［J］.J Clin Microbiol，2015，53（4）:1129-1136.

［11］Cao Y，Kim HJ，Li Y，et al.Helicase-dependent amplification of nucleic acids［J］.Curr Protoc Mol Biol，2013，104:Unit 15.11.

［12］Odari EO，Maiyo A，Lwembe R，et al.Establishment and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay for the semi-quantitative detection of HIV-1 group M virus［J］.J Virol Methods，2015，212:30-38.

［13］Crannell ZA，Rohrman B，Richards-Kortum R.Quantification of HIV-1 DNA using real-time recombinase polymerase amplification［J］.Anal Chem，2014，86（12）:5615-5619.

［14］Compton J.Nucleic acid sequence-based amplification［J］.Nature，1991，350（6313）:91-92.

［15］Mollasalehi H，Yazdanparast R.Non-crosslinking gold nanoprobes fordetectionofnucleicacidsequence-basedamplification products［J］.Anal Biochem，2012，425（2）:91-95.

［16］Zhao X，Dong T.Multifunctional sample preparation kit and onchip quantitative nucleic acid sequence-based amplification tests for microbial detection［J］.Anal Chem，2012，84（20）:8541-8548.

［17］Weusten JJ，Carpay WM，Oosterlaken TA，et al.Principles of quantitation of viral loads using nucleic acid sequence-based amplification in combination with homogeneous detection using molecular beacons［J］.Nucleic Acids Res，2002，30（6）:e26.

［18］de Mendoza C，Koppelman M，Montès B，et al.Multicenter evaluation of the NucliSens EasyQ HIV-1 v1.1 assay for the quantitative detection of HIV-1 RNA in plasma［J］.J Virol Methods，2005，127（1）:54-59.

［19］Mercier-Delarue S，Vray M，Plantier JC，et al.Higher specificity of nucleic acid sequence-based amplification isothermal technology than of real-time PCR for quantification of HIV-1 RNA on dried blood spots［J］.J Clin Microbiol，2014，52（1）:52-56.

［20］Heid CA，Stevens J，Livak KJ，et al.Real time quantitative PCR ［J］.Genome Res，1996，6（10）:986-994.

［21］Tung YC，Ke LY，Lu PL，et al.Comparison of the Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 test v1.0 with v2.0 in HIV-1 viral load quantification［J］.Kaohsiung J Med Sci，2015，31（4）:188-193.

［22］Huang D，Zhuang Y，Zhai S，et al.HIV reverse transcriptase activity assay:a feasible surrogate for HIV viral load measurement in China［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2010，68（3）:208-213.

［23］Sun AL，Deng K，F(xiàn)u WL.Exonuclease III-based target recycling for ultrasensitive homogeneous monitoring of HIV DNA using Ag+-coordinated hairpin probe［J］.Biosens Bioelectron，2015，74:66-70.

［24］Shafiee H，Lidstone EA，Jahangir M，et al.Nanostructured optical photonic crystal biosensor for HIV viral load measurement［J］.Sci Rep，2014，4:4116.

［25］Yan Z，Gan N，Zhang H，et al.A sandwich-hybridization assay for simultaneous determination of HIV and tuberculosis DNA targets based on signal amplification by quantum dots-PowerVisionTMpolymer coding nanotracers［J］.Biosens Bioelectron，2015，71:207-213.

［26］Holguín A，López M，Molinero M，et al.Performance of three commercial viral load assays，Versant human immunodeficiency virus type 1（HIV-1）RNA bDNA v3.0，Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1，and NucliSens HIV-1 EasyQ v1.2，testing HIV-1 non-B subtypes and recombinant variants［J］.J Clin Microbiol，2008，46 （9）:2918-2923.

［27］Lubelchek RJ，Max B，Sandusky CJ，et al.Reliability at the lower limits of HIV-1 RNA quantification in clinical samples:a comparison of RT-PCR versus bDNA assays［J］.PLoS One，2009，4（6）:e6008.

［28］Pan P，Tao X，Zhang Q，et al.Clinical comparison of branched DNA and reverse transcriptase-PCR and nucleic acid sequencebased amplification assay for the quantitation of circulating recombinant form_BC HIV-1 RNA in plasma［J］.AIDS，2007，21 （Suppl 8）:S27-S32.

［29］Pyne MT，Brown KL，Hillyard DR.Evaluation of the Roche Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 test and identification of rare polymorphisms potentially affecting assay performance［J］.J Clin Microbiol，2010，48（8）:2852-2858.

［30］Müller B，Nübling CM，Kress J，et al.How safe is safe:new human immunodeficiency virus Type 1 variants missed by nucleic acid testing［J］.Transfusion，2013，53（10 Pt 2）:2422-2430.

（2015-10-10收稿2015-11-17修回）

（責(zé)任編委曲芬本文編輯盧福昱）

Current techniques and research progress of HIV-1 viral load testing

ZHANG Ling，JIANG Yan，PAN Pin-liang*National Center for AIDS/STD Control and Prevention，China Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China *Corresponding author，E-mail:panpinliang@chinaaids.cn

Viral load testing is a pivotal measurement of HIV-1 infections，and is meaningful in fundamental research，diagnosis of acute infection，therapeutic research as well as epidemiological monitoring.Classical HIV viral load testing refers to the measurement of viral RNA by techniques such as real-time PCR，isothermal amplification of nucleic acid，or branched DNA hybrization.Sample candidates cover serum，discharge and dried whole blood spots，and consequently，the testing target expands to pro-viral DNA integrated in the host genome.In addition，more and more techniques，including reverse transcriptase assay and new isothermal amplification，are applied in the testing，and interdisciplinary attempts are still under way.Presently，HIV-1 viral load testing is carried out in more than 140 laboratories in China，among which three cardinal techniques are applied.In spite of the different nature of the techniques，they all play an important role in HIV viral load testing.

HIV-1；viral load；branched DNA signal amplification assay；review

潘品良，E-mail:panpinliang@chinaaids.cn

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.06.005

國(guó)家“十二五”科技重大專項(xiàng)（2012ZX10001001-001-002）

102206北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心（張嶺、蔣巖、潘品良）