功勞木的化學(xué)成分及其體外對P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

郭敬功，劉　靜，李沙沙，沈　姍，王江英，王天曉，叢　悅*

(1. 河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004；2. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004)

功勞木的化學(xué)成分及其體外對P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

郭敬功1，劉靜2，李沙沙2，沈姍2，王江英2，王天曉2，叢悅2*

(1. 河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004；2. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004)

摘要：目的研究功勞木的化學(xué)成分，評價(jià)其體外對P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。方法功勞木用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇提取，得到的浸膏經(jīng)硅膠干柱色譜分成8份，其中第3~5份和第8份經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離得到3個(gè)化合物，利用理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并檢測3個(gè)化合物對耐藥細(xì)胞株K562/ADM細(xì)胞內(nèi)羅丹明(rhodamine123，Rh123)蓄積的影響。結(jié)果顯示3個(gè)化合物分別為：1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S, 4R,8E)-2- [(2’R)-2’-hydroxytetra cosenoilamino]- 8-octadec-ene-1, 3, 4-triol (1)、erthro-syringoyl glycerol 4-O-β-D-glucoside (2)、葡萄糖(3)。結(jié)論化合物1~3為首次從本屬植物中分離得到，化合物1和2明顯增加耐藥細(xì)胞株K562/ADM細(xì)胞內(nèi)羅丹明(rhodamine123，Rh123)蓄積量，表現(xiàn)出抑制P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能的活性。

關(guān)鍵詞：功勞木；化學(xué)成分；糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)；耐藥性

功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞Mahonia bealaei(Fort)Carr.的莖，十大功勞屬植物全世界約有100種，中國約占35種，該屬大多數(shù)植物是分布國的傳統(tǒng)藥或民間藥，具有清涼、解毒、滋陰、強(qiáng)壯之功效，民間常用于治療感冒、清熱、解毒、消炎鎮(zhèn)痛、利膽止瀉等疾病[1-2]。現(xiàn)代藥理研究[3-4]表明，該屬植物所含的生物堿具有很好的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用和逆轉(zhuǎn)大腸桿菌耐藥性作用。我們課題組對功勞木的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究并進(jìn)行了腫瘤多藥耐藥的篩選[5-7]，發(fā)現(xiàn)很多非生物堿成分逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用也很顯著。在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步研究功勞木的化學(xué)成分，并采用高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測化學(xué)成分對耐藥細(xì)胞株K562/ADM內(nèi)熒光染料羅丹明123(Rh123)蓄積量的影響[8-10]，探討功勞木化學(xué)成分對耐藥細(xì)胞株K562/ADM膜表面P-糖蛋白(P-gp)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響，為以后深入篩選逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的活性物質(zhì)提供重要的參考價(jià)值。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)儀器與藥劑

Bruker AVANCE 400M型核磁共振波譜儀；Bruker Esquire LC液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；JJ-CJ-2FD超凈化工作臺(tái)(吳江市凈化設(shè)備總廠) ；N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Eyela公司)；8000DH型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司) ；Arrary Scan VTIHCS 600型高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國Thermo公司)。

硅膠G(粒度200～300目，青島海洋化工廠)；薄層層析硅膠G(10～40 μm，青島海洋化工廠)；羅丹明123(Rh123, 美國Sigma公司)；Hoechst 33342(美國Sigma公司)；Sephadex LH-20(GE Healthcare) ； 維拉帕米(上海禾豐制藥有限公司)。功勞木購自亳州藥材市場，由河南大學(xué)藥學(xué)院叢悅副教授鑒定為小檗科闊葉十大功勞Mahoniabealaei(Fort.)Carr.的莖，植物標(biāo)本保存于河南大學(xué)藥物研究所。K562/ADM(人紅白血病阿霉素耐藥細(xì)胞株) 購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1功勞木化學(xué)成分的提取分離功勞木干燥飲片7.0 kg，35 L 體積分?jǐn)?shù)為 70%乙醇加熱提取，提取5次，每次2.5 h，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，得到提取物911 g，提取物經(jīng)硅膠干柱色譜分離，用氯仿-甲醇-水(8∶2∶0.2)洗脫，均分8份，每份均用氯仿-甲醇(3∶2→純甲醇)梯度洗脫，回收溶劑濃縮。合并第3、4、5份樣品經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，氯仿-甲醇(200∶1→純甲醇)梯度洗脫，第185～188餾分經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(4∶6∶1)洗脫得化合物1 (15 mg)。第8份樣品經(jīng)Sephadex LH-2柱層析和反復(fù)硅膠柱層析，洗脫劑為氯仿-甲醇-水-冰乙酸(4∶1∶0.1∶ 0.1)，得到化合物2(22 mg)和化合物3(17 mg)。

1.2.2K562/ADM細(xì)胞株的培養(yǎng)見文獻(xiàn)[7]。

1.2.3逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性成分的篩選方法見文獻(xiàn)[7]。

2結(jié)果與分析

2.1　功勞木乙醇提取物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末, Molish反應(yīng)陽性, ESI-MS m/z：876.5[M+35Cl]-, 878.5 [M+37Cl]-, 結(jié)合1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)推斷分子式為C48H91NO10, 參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)比較，推測該化合物為腦苷脂類成分。根據(jù)1H-NMR、13C-NMR、HMQC和HMBC譜將碳?xì)溥M(jìn)行了歸屬。1H-NMR (DMSO, 400 MHz) δ: 7.59(1H, d, J=9.2 Hz, NH), 5.34 (1H, m, H-8), 5.31 (1H, m, H-9), 5.28 (2H, m, H-15’, 16’), 4.05 (1H, m, H-2), 3.61 (1H, m, H-1), 3.80 (1H, m, H-1), 3.33 (1H, m, H-4), 3.82 (1H, m, H-2’), 3.34 (1H, m, H-3), 4.12(1H, d, J=8.0 Hz, Glc-1), 1.57(2H, m, H-3’, 5), 1.50(2H, m, H-6), 1.47(2H, m, H-3’, 5), 1.96 (8H, m, H-7, 10, 14’, 17’), 1.22~1.40 (46H, m, H-11~17, 4’~13’, 18’~23’), 0.83 (6H, t, J=6.8 Hz, CH3-24’, 18)。13C-NMR (DMSO, 100 MHz) δ:174.3(C-1’), 130.8 (C-8), 129.9 (C-9), 129.8 (C-15’,16’), 103.9 (Glc-1’), 77.3 (Glc-5’), 76.9 (Glc-3’), 73.9 (C-3, Glc-2’),71.4 (C-2’), 71.0 (Glc-4’), 71.4 (C-4), 70.3 (C-1), 61.4 (Glc-6’), 50.3 (C-2), 34.9 (C-10), 34.8 (C-3’), 31.8 (C-5, 7, 16, 22’), 27.0 (C-14’), 27.1(C-17’), 26.1(C-6), 24.9 (C-4’), 22.6(C-17, 23’), 29.0~29.6 (C-11~15, 5’ ~13’, 18’ ~21’), 14.3 (C-18, 24’)。

采用甲醇分解反應(yīng)[11-12]制備化合物1結(jié)構(gòu)上的脂肪鏈和堿基鏈，進(jìn)行ESI-MS分析，結(jié)果顯示脂肪酸甲酯(m/z)：419.1 [M+Na]+，堿基鏈(m/z)：316.2 [M+H]+，以上數(shù)據(jù)結(jié)果與文獻(xiàn)[13]基本一致，確定化合物1為1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S, 3S, 4R, 8E)-2-[(2’R)-2’-hydroxytetracosenoilamino]-8-octadecene-1, 3, 4-triol。

化合物2白色粉末, Molish反應(yīng)陽性, ESI-MS m/z: 429.2 [ M+Na ]+, 1H-NMR (DMSO, 400 MHz) δ: 6.65(2H, s, H-2, 6), 4.85(1H, d, J=7.2 Hz, Glc-1), 4.52(1H, d, J=5.6 Hz, H-7)，3.74(6H, s, 2×OCH3), 3.48 (1H, m, H-8), 3.60 (1H, dd, J=4.0, 12.0 Hz, Glc-6), 3.45 (1H, m, Glc-6), 3.39(1H, m, H-9)，3.10~3.23(4H, m, Glc-5, Glc-2, Glc-4, H-9), 3.03(1H, m, Glc-3)。13CNMR (DMSO, 100 MHz) δ: 152.5 (C-3, 5), 139.8 (C-4), 133.7(C-1), 103.3(Glc-1), 105.4(C-2, 6), 73.0 (C-7), 76.0 (C-8), 63.1 (C-9), 56.8 (2×OCH3), 61.4 (Glc-6), 70.4 (Glc-4), 74.6(Glc-2), 77.6 (Glc-5), 76.9(Glc-3)。經(jīng)與文獻(xiàn)[14]數(shù)據(jù)對照基本一致。因此, 鑒定化合物2為erthro-syringoylglycerol 4-O-β-D-glucosidea。

化合物3 白色粉末, ESI-MS m/z：181.2[M+H]+,1H-NMR (D2O, 400 MHz) δ: 5.25(1H, d, J=3.6 Hz, α-Glc-1), 4.66(1H, d, J=7.6 Hz, β-Glc-1);13C-NMR (D2O, 100 MHz) δ: 95.9(β-Glc-1), 74.1(β-Glc-2), 75.7(β-Glc-3), 69.6(β-Glc-4), 75.9(β-Glc-5), 60.7(β-Glc-6), 92.1(α-Glc-1), 71.4(α-Glc-2), 72.8(α- Glc-3), 69.6(α-Glc-4), δ71.5(α-Glc-5), 60.6 (α-Glc-6)。數(shù)據(jù)結(jié)果與文獻(xiàn)[15-16]一致，表明化合物3為α-葡萄糖和β-葡萄糖兩種構(gòu)型的混合物。

2.2　3種化合物體外逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性

應(yīng)用高內(nèi)涵方法[7]檢測化合物1～3對耐藥細(xì)胞株K562/ADM內(nèi)Rh123蓄積量的影響。化合物1和2給藥濃度為10 μmol/L時(shí)，Rh123熒光強(qiáng)度增長率分別為24.01%、5.17%；給藥濃度為50 μmol/L時(shí)，Rh123熒光強(qiáng)度增長率分別為39.32%、8.63%?；衔?與空白組比較熒光強(qiáng)度無變化。陽性對照維拉帕米給藥濃度為10 和50 μmol/L時(shí)，Rh123熒光強(qiáng)度增長率分別為3.24%、 34.20%。結(jié)果表明化合物1和2都影響細(xì)胞膜上P-糖蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，使耐藥細(xì)胞株K562/ADM內(nèi)Rh123蓄積量發(fā)生改變，其中化合物1的活性最強(qiáng)。

3討論

我們采用柱色譜法，從功勞木的乙醇提取物中分離得到3個(gè)化合物，1-O-(β-D- glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2’R)-2’-hydroxytetracosenoilamino]-8-octadecene-1, 3, 4-triol (1)、erthro-syringoyl glycerol 4-O-β-D-glucoside (2)、葡萄糖(3)均為首次從該屬植物中分離得到。并采用高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測分析了這3個(gè)成分對K562/ADM細(xì)胞內(nèi)RH123蓄積的變化，以檢測其對細(xì)胞膜上P-gp功能的影響。由于P-gp在許多組織有分布，是一種ATP依賴性膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)子，其作用類似于排出泵，可將藥物從細(xì)胞內(nèi)外排而使胞內(nèi)藥物濃度降低，從而降低藥效，所以P-gp參與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：化合物1顯著抑制耐藥細(xì)胞株P(guān)-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能。化合物1屬于大豆腦苷類成分，結(jié)合前期研究結(jié)果[7], 發(fā)現(xiàn)這類成分具有一定潛在的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的活性特點(diǎn)，為日后深入研究逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的藥效物質(zhì)篩選，提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[責(zé)任編輯李武營]

Chemical constituents from the stem of mahonia bealei (Fort.) carr on p-glycoprotein transport

GUO Jinggong1, LIU Jing2, LI Shasha2, SHEN Shan2, WANG Jiangying2, WANG Tianxiao2, CONG Yue2

(1.HenanUniversityInstituteofPharmacy,Henan,Kaifeng475004,China；2.SchoolofLifeScience,Henan,Kaifeng475004,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of chemical constituents from the stem of Mahonia bealei (Fort.) Carr on P-glycoprotein transport. MethodsMahonia bealei (Fort.) Carr was extracted by 70% alcohol and the extract were separated by dry column chromatography over silica gel into 8 portions. Portions 3-5 and portion 8 were separated and purified by repeated column chromatography on silica gel to get three compounds. Each compound was characterized by spectroscopic and physical data. The effects of three compounds on Rhodamine123 accumulation in K562/ADM cells were detected by high content screening analysis. ResultsThree compounds have been purified and identified as 1-O-(β-D-glucopyranosyl) -(2S, 3S, 4R, 8E)-2- [(2’R) -2’-hydroxytetracosenoilamino]-8-octadecene-1,3,4-triol(1), erthro-syringoyl glycerol4-O-β-D-glucoside(2) and glucose(3) respectively. Conclusion Compounds 1~3 were obtained for the first time from the genus Mahonia.Compounds 1 and 2 significantly increased accumulation of Rh123 in K562/ADM cells, and showed inhibition of P-glycoprotein transport function.

Key words:Mahonia bealei; chemical constituents; structure identification; multidrug resistance

*通訊作者：叢悅(1978-)，女，遼寧遼陽市人，博士，副教授，從事中藥化學(xué)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。

作者簡介：郭敬功(1982-)，男，山東菏澤市人，實(shí)驗(yàn)師，從事細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究工作。

收稿日期：2015-05-12

文章編號(hào)：1672-7606(2015)03-0163-03

中圖分類號(hào)：TQ460.72

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A