丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷狀態(tài)下SP-B表達(dá)的調(diào)節(jié)作用*

王慧娟　馮社軍　李軍濤　武艷強(qiáng)

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

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丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷狀態(tài)下SP-B表達(dá)的調(diào)節(jié)作用*

王慧娟馮社軍李軍濤武艷強(qiáng)

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

【摘要】目的探討丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用和對肺組織肺表面活性蛋白B(SP-B)的調(diào)節(jié)作用。方法30只雄性Wistar大鼠(SPF級)隨機(jī)分為對照組(Control組)、治療組(LPS+Propofol組)和模型組(LPS組)每組10只。通過頸靜脈注射LPS建立大鼠急性肺損傷(ALI)模型。采用HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變并進(jìn)行肺損傷評分；采用濕/干比(W/D)值分析肺水腫嚴(yán)重程度；使用RT-PCR和western blotting對肺組織中SP-B的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果在給予頸靜脈注射LPS后，大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變和較高的肺損傷評分，W/D值明顯升高，同時肺組織中SP-B mRNA和蛋白水平明顯降低，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但與LPS組相比較，LPS+Propofol組大鼠肺組織病理變化較輕，肺損傷評分和W/D值較低，同時肺組織中SP-B mRNA和蛋白的表達(dá)水平較高，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論鎮(zhèn)靜藥丙泊酚可以有效改善大鼠ALI導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)和肺水腫，同時上調(diào)肺組織中SP-B的表達(dá)水平。但仍需進(jìn)一步研究揭示丙泊酚對于ALI狀態(tài)下SP-B的調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制和相關(guān)的信號通路。

【關(guān)鍵詞】丙泊酚； 急性肺損傷； 急性呼吸窘迫綜合征； 肺表面活性蛋白B

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一個疾病的連續(xù)兩個不同階段，其實(shí)質(zhì)是各種嚴(yán)重的急性肺內(nèi)和肺外病因包括重癥肺炎、嚴(yán)重膿毒血癥和重癥胰腺炎等導(dǎo)致的肺部的自我放大的和失控的炎癥反應(yīng)[1~4]。肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)是維持肺順應(yīng)性和肺內(nèi)液體平衡的重要物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)在ALI/ARDS狀態(tài)下PS的表達(dá)明顯降低，且與ALI/ARDS的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[5, 6]。目前多個研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚(propofol)具有抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的作用，同時還有研究證實(shí)丙泊酚對炎癥狀態(tài)下的肺上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[7~10]。本實(shí)驗(yàn)的目的是探討在ALI狀態(tài)下丙泊酚對肺組織的保護(hù)作用和對肺表面活性蛋白B (surfactant protein B, SP-B)的調(diào)節(jié)作用。

1材料和方法

1.1主要材料30只雄性Wistar大鼠(SPF級，6~8周，體重約180~220g)購于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，分籠飼養(yǎng)，自由飲水與攝食。電泳單元及電泳附件、電源、濕轉(zhuǎn)式電轉(zhuǎn)儀和凝膠成像系統(tǒng)由Bio-rad公司提供。大腸埃稀桿菌內(nèi)毒素(LPS)購自美國Sigma公司。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成?？俁NA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自美國Mbi Fermentas公司，SP-B和β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2方法

1.2.1動物模型建立30只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)平均分為對照組(Control組)、治療組(LPS+propofol組)和模型組(LPS組)，每組10只。腹腔注射戊巴比妥(40mg/Kg)麻醉大鼠。治療組和模型組大鼠通過頸靜脈注射LPS (5mg/Kg)誘導(dǎo)建立ALI模型。對照組給予生理鹽水代替LPS。在LPS干預(yù)前30min和干預(yù)后30min，分別對治療組大鼠以6mg/kg/min持續(xù)泵入丙泊酚(樂維靜，四川國瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司) 5min，共2次[8]。LPS干預(yù)6h后處死大鼠，獲取肺組織備用。

1.2.2HE染色觀察病理變化并進(jìn)行肺損傷評分取右下肺組織，常規(guī)制成5μm的石蠟切片，HE染色觀察肺損傷程度，并進(jìn)行肺損傷評分[7]。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：①肺泡充血。②出血。③肺泡腔或血管腔中性粒細(xì)胞浸潤或聚集。④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成四項指標(biāo)，分別依病變輕重評0~4分(0：無病變或非常輕微；1：輕度病變；2：中度病變；3：重度病變；4：極重度病變)。各項評定分?jǐn)?shù)相加為ALI總評分[4]。血液離心后吸取血漿，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3肺組織濕/干比(wet to dry ratio, W/D)測定大鼠處死后取出肺部組織。將樣本置于80℃烤箱24h至恒重后，記錄前后肺組織重量，計算W/D值。

1.2.4RT-PCR法檢測SP-B mRNA表達(dá)取左下葉肺組織，按照試劑盒說明書提取總RNA。以2μg總RNA為模板，用Oligo (dT)18作為引物，按照試劑盒說明書介紹要求合成cDNA第1鏈。SP-B正義5′-GAGGATATTGTCCACCTCCT -3′，反義5′-ATAGCCTGTTCACTGGTGT -3′；β-actin引物：正義：5′-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，反義：5′-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3′，PCR反應(yīng)體系如下：2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物模板、PCR Master Mix (2×) 25μl、正反引物各2μl，以超純水補(bǔ)充至50μl。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對目的條帶進(jìn)行掃描分析。用SP-B/β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為SP-B mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5Western blot法檢測肺組織蛋白表達(dá)首先提取肺組織總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入兔抗鼠單克隆抗體磷酸化SP-B (1∶ 800)和β-actin (1∶ 5000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

2結(jié)果

2.1肺組織病理變化肺組織切片進(jìn)行HE染色后光鏡下觀察。對照組(Control組)：肺組織未見炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔均勻無增寬，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，無紅細(xì)胞和透明膜形成，為正常肺組織。模型組(LPS組)：肺組織存在大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔中大量水腫液，并可見較多紅細(xì)胞進(jìn)入肺泡腔，肺泡腔中可見透明膜形成。治療組(LPS+Propofol組)：肺組織中存在炎癥細(xì)胞浸潤但較模型組明顯減少，肺泡間隔輕度增寬，肺泡中少量紅細(xì)胞和水腫液聚集，可見肺間質(zhì)肺水腫。模型組大鼠肺組織損傷評分明顯高于治療組(P<0.05)，見圖1、表1。

表1　三組大鼠肺組織損傷評分和W/D值±s)

注：與Control組比較①P<0.05，與LPS組比較②P<0.05

2.2肺組織SP-B表達(dá)水平采用RT-PCR和western blotting對肺組織中SP-B mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測。在經(jīng)頸靜脈注射LPS 6h后，大鼠肺組織中SP-B mRNA和蛋白水平均明顯下降(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，LPS+Propofol組大鼠肺組織中SP-B表達(dá)水平較LPS組明顯增加(P<0.05)，見圖2、表2。

表2　三組大鼠肺組織SP-B mRNA和蛋白的表達(dá)水平

注：與Control組相比較，①P<0.05，與LPS組相比較②P<0.05

圖1三組大鼠肺組織病理變化(HE染色，×200倍)

Figure 1The pathological changes in each group (HE staining, ×200)

圖2三組大鼠肺組織SP-B表達(dá)RT-PCR和western blotting結(jié)果

Figure 2The RT-PCR and western blotting results of SP-B in rats

3討論

急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一個疾病連續(xù)的兩個階段。各種嚴(yán)重的急性肺內(nèi)和肺外病因包括重癥肺炎、嚴(yán)重膿毒血癥和重癥胰腺炎等導(dǎo)致的肺部的自我放大的和失控的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ALI/ARDS發(fā)生的根本原因[1~4, 11]。目前研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致ALI/ARDS直接原因[1~4, 11]。同時肺表面活性物質(zhì)(PS)對維持肺泡的穩(wěn)定性和肺組織順應(yīng)性、調(diào)節(jié)肺內(nèi)液體平衡以及調(diào)節(jié)肺組織固有免疫和炎癥反應(yīng)均有重要的作用[5, 6]。PS的減少是ALI/ARDS重要的病理生理學(xué)改變之一。

PS作為一種大分子聚合物，化學(xué)成分非常復(fù)雜。PS主要由Ⅱ肺泡上皮細(xì)胞合成和分泌，包括磷脂和蛋白兩部分，其他還包括糖脂和中性脂質(zhì)。二棕櫚酸磷脂酰膽堿(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)是PS中降低肺泡表面張力的最主要物質(zhì)。表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(surfactant-associated protein, SP)包括4種，即SP-A、SP-B、SP-C和SP-D，其中SP-A和SP-D為親水性蛋白；SP-B和SP-C為疏水性蛋白[5, 6, 12~14]。目前研究認(rèn)為在ALI/ARDS狀態(tài)下PS的減少與肺容積減少，肺泡塌陷，肺組織順應(yīng)性下降，高通透性肺水腫和氧合功能障礙等密切相關(guān)[12~14]。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)若能夠上調(diào)PS成分的表達(dá)或外源性給予PS可有效的改善ARDS的病理變化、臨床癥狀以及患者預(yù)后[12~14]。

SP-B是PS重要的蛋白成分。SP-B基因首先經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯成約為42 kDa的單體前蛋白原，再經(jīng)過修飾后形成成熟的SP-B同二聚體。SP-B可促進(jìn)肺泡表面磷脂的吸附，具有維持肺泡完整性和氣-液表面單分子層的穩(wěn)定性降低肺泡表面張力的作用。管狀髓磷脂由PS成分有機(jī)結(jié)合構(gòu)成，是PS功能的基礎(chǔ)，SP-B是管狀髓磷脂形成的必需成分。同時研究證實(shí)SP-B還具有抑制肺部炎癥反應(yīng)的作用[14, 15]。研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)PS組SP-A、SP-B和DPPC等的表達(dá)，對ALI/ARDS有保護(hù)作用[14, 15]。目前多個研究發(fā)現(xiàn)在多種病理狀態(tài)下，丙泊酚(propofol)具有抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的作用[7~10]。同時還有研究證實(shí)丙泊酚對炎癥狀態(tài)下的肺上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[8]。

我們研究發(fā)現(xiàn)在給予大鼠頸靜脈注射LPS 6h后，大鼠肺組織出現(xiàn)顯著的病理學(xué)改變包括大量炎癥細(xì)胞浸潤，明顯的肺泡間隔增寬，肺泡腔中大量水腫液，并可見較多紅細(xì)胞進(jìn)入肺泡腔，肺泡腔中可見透明膜形成等(見圖1)。但給予丙泊酚干預(yù)的大鼠病理改變明顯較模型組減輕。且進(jìn)行肺損傷評分證實(shí)LPS+Propofol組大鼠評分較LPS組大鼠明顯降低(表1)。肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的高通透性肺水腫是ARDS特征性改變之一。嚴(yán)重的肺水腫可直接導(dǎo)致有效肺容積降低，肺泡順應(yīng)性下降和氧合功能障礙，是導(dǎo)致ARDS患者早期死亡的重要原因[2]。本試驗(yàn)中我們使用肺濕/干比(wet to dry ratio, W/D)對各組肺組織水腫程度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LPS干預(yù)后大鼠肺組織W/D顯著增加，但LPS+Propofol組大鼠W/D較LPS組較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明丙泊酚可以有效的抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI肺部炎癥反應(yīng)和肺水腫，對大鼠肺組織有保護(hù)作用。

進(jìn)一步采用RT-PCR和western blotting法對SP-B mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)LPS干預(yù)后大鼠肺組織SP-B表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，與LPS組相比較LPS+Propofol組大鼠肺組織中SP-B表達(dá)明顯增加(P<0.05) (圖2、表2)。該結(jié)果表明丙泊酚可有效上調(diào)大鼠ALI狀態(tài)下肺組織SP-B的表達(dá)水平。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究表明丙泊酚能有效減輕LPS誘導(dǎo)大鼠ALI導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)和高通透性肺水腫，并可能與上調(diào)SP-B的表達(dá)密切相關(guān)。但仍需進(jìn)一步的研究揭示丙泊酚調(diào)節(jié)SP-B的分子機(jī)制和相關(guān)的信號通路。

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Propofol enhances surfactant protein B in LPS-induced acute lung injury in rats

WANG Hui-juan，F(xiàn)ENG She-jun，LI Jun-tao,etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of propofol on the expression of surfactant protein B (SP-B) in LPS-induced acute lung injury (ALI) in rats. Methods30 male Wistar rats were randomly divided into Control group, LPS+Propofol group and LPS group. HE staining and lug injury scores system were performed to analyze the pathological changes in lung. Wet to dry ratio (W/D) was used to detect the degree of lung edema. RT-PCR and western blotting were used to measure the expression of SP-B in lung. ResultsAfter 6h LPS injection, severe pathological changes, raised W/D, and reduction of SP-B in lung were observed. Nevertheless, compared with LPS group, pathological changes, lung injury scores and W/D were significantly attenuated. Meanwhile, SP-B expression was markedly promoted by propofol treatment. ConclusionOur data show that propofol enhanced the expression of SP-B in a rat model of LPS induced ALI.

【Key words】Propofol; Acute lung injury; acute respiratory distress syndrome; Surfactant protein B

(收稿日期：2014-04-14； 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：李軍濤,E-mail：lijuntao2014@163.com

基金項目：河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科研計劃(20130359)

【中圖分類號】R 563.8

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.01.003