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    脂氧素A4及其受體對急性肺損傷Na+—K+—ATP酶的影響

    2016-11-15 02:52陳芳王倩
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2016年23期
    關鍵詞:急性肺損傷

    陳芳+王倩

    [摘要] 目的 研究脂氧素A4及其受體對大鼠急性肺損傷Na+-K+-ATP酶的影響及機制。 方法 將大鼠隨機分為7組:①對照組;②油酸(OA)組;③油酸+脂氧素A4(OA+LX)組;④OA+Alcohol組;⑤油酸+BML-111組(OA+BML-111組);⑥油酸+脂氧素A4+BOC-2(OA+LX+BOC-2)組;⑦OA+DMSO組。機械通氣1 h后處死,取肺組織測定Na+-K+-ATP酶α1、β1亞基蛋白表達和Na+-K+-ATP酶活性。 結果 與OA組比較,OA+LX組和OA+BML-111組肺組織Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高(P<0.05),Na+-K+-ATP酶活性明顯增強(P<0.05);與OA+LX組比較,BOC-2抑制Na+-K+-ATP酶的活性(P<0.01)。 結論 脂氧素通過上調Na+-K+-ATP酶蛋白表達及活性減輕油酸誘導的大鼠急性肺損傷,其作用機制與脂氧素受體(ALX)相關。

    [關鍵詞] Na+-K+-ATP酶;急性肺損傷;脂氧素;脂氧素受體

    [中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2016)23-0021-05

    [Abstract] Objective To study the effect of lipoxin A4 and its receptor on Na+-K+-ATPase in acute lung injury. Methods SD rats were divided randomly into seven groups: ①control group; ②OA group; ③OA+LX group; ④OA+Alcohol group; ⑤OA+BML-111 group; ⑥OA+LX+BOC-2 group; ⑦OA+DMSO group. After 1 h of mechanical ventilation, lung samples were harvested. The protein of lung tissue samples was isolated to measure Na+-K+-ATPase protein expression and Na+-K+-ATPase activity. Results Compared with OA group, Na+-K+-ATPase β1 subunit protein expression and Na+-K+-ATPase activity were significantly increased in OA+LX group and OA+BML-111 group. Compared with OA+LX group, the beneficial effects of lipoxinA4 were abrogated by BOC-2(P<0.01). Conclusion Lipoxin can up-regulated Na+-K+-ATPase β1 subunit protein expression and Na+-K+-ATPase activity in acute lung injury, and its mechanism is through ALX cGMP.

    [Key words] Na+-K+-ATPase; Acute lung injury; Lipoxin; Lipoxin receptor

    急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)是臨床常見的急危重癥,病死率高達50%[1-3]。其主要病理變化為肺組織大量炎性浸潤和肺泡-毛細血管屏障損傷引起的肺水清除障礙、肺水積聚。肺泡內水腫液的及時主動清除是治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征的關鍵措施[4]。Na+-K+-ATP酶在水腫液主動清除過程中具有至關重要的作用[5-9]。肺泡Ⅱ型上皮細胞基底膜Na+-K+-ATP酶將細胞內Na+主動轉運至肺間質,形成Na+濃度滲透梯度,進而產生肺泡腔內液體重吸收。另外,研究發(fā)現(xiàn),Na+-K+-ATP酶參與形成和維持肺泡上皮的緊密連接,從而影響肺泡上皮細胞的屏障功能[10-13]。因此,該酶功能的變化和調節(jié)對肺水的清除起著至關重要的作用。本實驗研究促炎癥消退介質脂氧素對大鼠急性肺損傷肺組織Na+-K+-ATP酶的調控及可能機制,為治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征提供新的思路和實驗依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1動物

    SPF級健康Sprague Dawley(SD)雄性大鼠56只,體重200~250 g,由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供(動物許可證:X1004258)。

    1.2 主要試劑與儀器

    脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)購自美國 Cayman,脂氧素A4受體激動劑(BML-111)和脂氧素A4受體抑制劑(BOC-2)均購自美國Biomol-Enzo Life Sciences,抗Na+-K+-ATP酶α1和β1抗體購自美國Abcam公司,油酸購自美國Sigma公司。小型動物呼吸機TKF-200c為江西麻醉呼吸設備公司,蛋白電泳系統(tǒng)為美國BioRAD,凝膠成像分析系統(tǒng)為英國的GDS 8000。

    1.3 油酸損傷模型的建立

    取SD雄性大鼠,戊巴比妥鈉麻醉后行氣管插管,機械通氣。經股靜脈分別注射生理鹽水或純油酸0.03 mL/kg。100%氧氣機械通氣1 h后,肺組織HE染色,透射電鏡下觀察。

    1.4 動物分組及給藥

    雄性SD大鼠隨機分為7組,每組8只:①空白對照組:股靜脈注入等體積的0.9%生理鹽水;②油酸組(oleic acid group,OA 組):股靜脈注入0.03 mL/kg油酸;③油酸+脂氧素A4組(oleic acid+lipoxin group,OA+LX組):股靜脈注入0.03 mL/kg油酸形成急性肺損傷10 min后,經股靜脈注入脂氧素A4 2 μg/kg;④溶劑對照組(OA+Alcohol組):股靜脈注入0.03 mL/kg油酸10 min,乙醇(Alcohol,脂氧素A4的溶劑)20 μL/kg經股靜脈注入;⑤油酸+BML-111組(OA+BML-111組):0.03 mL/kg油酸刺激10 min后,BML-111(1 mg/kg,脂氧素A4受體激動劑)股靜脈注入;⑥油酸+脂氧素A4+BOC-2組(OA+LX+BOC-2組):股靜脈注射0.03 mL/kg油酸與2 μg/kg脂氧素A4后,BOC-2(600 ng/kg)經股靜脈注射;⑦溶劑對照組(OA+DMSO組):股靜脈注入0.03 mL/kg油酸10 min,經股靜脈注入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(BML-111和BOC-2的溶劑)。大鼠機械通氣1 h,腹主動脈放血處死,分離肺組織置液氮中速凍,然后-80℃保存。

    1.5 檢測Na+-K+-ATP酶α1、β1亞基蛋白表達

    肺組織勻漿后提取蛋白并定量,加蛋白上樣緩沖液,煮沸后保存。加入SDS-PAGE膠孔中進行電泳、轉膜、封閉。最后加入抗Na+-K+-ATP酶α1和β1抗體(1∶1000),4℃過夜;第2天洗膜,加入二抗(1∶5000),室溫孵育1 h;洗滌,ECL顯影、曝光。

    1.6 Na+-K+-ATP酶活性檢測

    ATP酶分解ATP為ADP、AMP和Pi,通過測定Pi的量判斷ATP酶的活性。ATP酶活性單位以每小時每毫克蛋白分解ATP產生1 mmol Pi的量定義為一個ATP酶活力單位。按微量Na+-K+-ATP酶試劑盒(南京建成)說明書進行測定。

    1.7 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析處理,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組樣本比較進行方差齊性檢驗,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 油酸肺損傷模型建立

    對照組肺組織結構清楚,支氣管黏膜上皮排列整齊,肺泡壁無明顯增厚,肺泡腔干凈、無明顯滲出,而油酸(OA)組肺組織充血明顯,肺泡間質有炎性浸潤,肺泡壁增寬,肺泡腔內可見出血和滲出(封三圖4)。

    2.2 脂氧素A4對油酸誘導急性肺損傷大鼠Na+-K+-ATP酶的影響

    與對照組比較,OA組Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高(P<0.05);與OA組和OA+Alcohol組比較,油酸+脂氧素組(OA+LX)Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高(P<0.05);OA組、OA+Alcohol組和油酸+脂氧素組(OA+LX)Na+-K+-ATP酶α1亞基蛋白表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1A)。

    與對照組比較,OA組Na+-K+-ATP酶活性增強(P<0.05);與OA組和OA+Alcohol組比較,油酸+脂氧素組(OA+LX)Na+-K+-ATP酶活性顯著增強(P<0.01)(圖1B)。

    2.3 BML-111 對油酸誘導急性肺損傷大鼠Na+-K+-ATP酶的影響

    與空白對照組比較,OA組Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高(P<0.05);與OA組和OA+DMSO組比較,油酸+BML-111組Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高(P<0.05);OA組、OA+DMSO組、油酸+BML-111組Na+-K+-ATP酶α1亞基蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    與空白對照組比較,OA組Na+-K+-ATP酶活性增強(P<0.05);與OA組和OA+DMSO組比較,油酸+BML-111組Na+-K+-ATP酶活性顯著增強(P<0.05)。

    2.4 BOC-2 對油酸誘導急性肺損傷大鼠Na+-K+-ATP酶活性的影響

    與OA組比較,油酸+脂氧素組Na+-K+-ATP酶活性增強(P<0.01);與油酸+脂氧素組相比,BOC-2抑制Na+-K+-ATP酶的活性(P<0.01)。

    3 討論

    ALI/ARDS是一種急性呼吸衰竭綜合征,雖然醫(yī)療條件和技術不斷發(fā)展,但其病死率仍然極高[14,15]。學者們一直在探索尋找新的治療ALI/ARDS的策略和方法。肺水腫是內毒素性肺損傷并發(fā)急性呼吸功能衰竭的主要病理基礎,肺泡水腫液的及時主動清除對急性肺損傷的預后有重要影響。Na+-K+-ATP酶是主要位于細胞膜上的跨膜離子轉運蛋白,具有維持細胞內外鈉鉀濃度梯度作用,是促進肺水沿著滲透梯度重吸收的關鍵。研究發(fā)現(xiàn),Na+-K+-ATP酶主要由α亞基和β亞基構成。α亞基為催化亞基,主要通過水解ATP提供能量完成細胞內Na+和細胞外K+交換,β亞基為調節(jié)亞基,控制酶組裝和鑲嵌到質膜[16],并維持細胞屏障功能,在肺水腫形成和消退過程中具有重要作用。

    脂氧素(lipoxins,LXs)為花生四烯酸(arachidonic acid,AA)脂加氧酶(lipoxygenase)的代謝產物,作為炎癥消退過程中產生的最重要的內源性抗炎促消退介質,脂氧素抑制中性粒細胞的趨化;調控炎癥因子的平衡;促進損傷組織的修復,防止其纖維化;促進中性粒細胞的凋亡及巨噬細胞的吞噬,因而稱為炎癥反應的“剎車信號”[15,17]。脂氧素已被多種實驗模型證實具有特異性肺保護作用,能夠減輕肺水腫,修復上皮細胞屏障功能[15,17,18]。作為重要的內源性促消退介質,脂氧素主要是與其受體(formyl peptide receptor-like 2,F(xiàn)PRL2/ALX)結合,從而對多種炎癥性疾病的預后產生影響。

    我們前期的研究已經證實,在內毒素性肺泡Ⅱ型上皮細胞模型中,LXA4可以上調Na+-K+-ATP酶的mRNA表達和酶活性,并證實在肺組織存在LXA4受體ALX表達[19]。本實驗則建立肺損傷動物模型,研究LXA4及其受體激動劑和受體抑制劑對內毒素性肺損傷Na+-K+-ATP酶的影響,從而進一步探討LXA4促進肺水吸收的機制。

    本實驗發(fā)現(xiàn),在油酸誘導的急性肺損傷模型中,脂氧素受體激動劑(BLM-111)與脂氧素一樣,具有一定的肺保護作用,都能提高Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達和Na+-K+-ATP酶活性。有學者研究證實,BLM-111對出血性休克和機械損傷性肺損傷也具有促炎癥消退作用[20,21]。Tang M等[14]研究發(fā)現(xiàn),BLM-111可以減輕內毒素性肺損傷,保護細胞屏障功能。但這一作用被脂氧素受體抑制劑(BOC-2)拮抗,提示脂氧素A4對Na+-K+-ATP酶的作用是通過脂氧素A4受體(ALX)介導的。目前發(fā)現(xiàn)的脂氧素受體主要有ALX、peptido-LT receptors(CysLTR1)和核受體AhR。ALX 是脂氧素信號通路中首先被鑒別并克隆的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors,GPCR)。

    本實驗證明脂氧素A4及其受體激動劑能夠上調油酸誘導的急性肺損傷Na+-K+-ATP酶蛋白的表達和酶活性,從而促進肺水清除;脂氧素A4 的上述作用是通過與其受體(ALX)結合發(fā)揮作用的。我們的研究進一步闡明了脂氧素A4及其受體對大鼠急性肺損傷Na+-K+-ATP酶的作用及促進肺水重吸收的機制,為治療ARDS 提供新的策略和依據(jù)。

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    (收稿日期:2016-05-28)

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