補陽還五湯對B MP 2/4介導(dǎo)軸突再髓鞘化的影響

趙 鵬饒耀劍崔澤升崔家偉

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院碩士研究生2 0 1 2級，福州 3 5 0 1 2 2；2河南省洛陽正骨醫(yī)院脊柱外三科，洛陽 4 7 1 0 0 2）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI） 是脊柱外科的常見病和疑難病之一，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）神經(jīng)元細胞損傷的不可修復(fù)性，常導(dǎo)致SCI患者遺留嚴重的神經(jīng)功能障礙而難以治愈，因此促進SCI神經(jīng)的再生和修復(fù)將是我們長期研究的目標。研究顯示SCI很少導(dǎo)致脊髓神經(jīng)纖維的完全離斷，SCI癱瘓患者保有的感覺、運動功能跟殘留神經(jīng)纖維作用的發(fā)揮是密切相關(guān)的。但是，繼發(fā)性損害導(dǎo)致殘存的神經(jīng)纖維脫髓鞘化，嚴重影響了殘存神經(jīng)纖維功能的發(fā)揮。因此，促進殘存軸突再髓鞘化對于殘留神經(jīng)纖維功能的發(fā)揮有著重要的意義。少突膠質(zhì)細胞 （Oligodendrocytes，OLs） 是CNS的唯一成鞘細胞，OLs形成、增殖、分化、成熟的發(fā)育過程中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (Bone morphogenetic proteins，BMP)、sonic hedgehog(Shh)、Notch等三種信號通路發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[1]。補陽還五湯（Bu yang huan wu Tang，BYHWT）是目前研究最多的治療SCI的有效方，因此本課題用BYHWT干預(yù)BMP，來觀察其對SCI殘存軸突再髓鞘化的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及儀器試劑 60只體重200~250 g的SPF級SD大鼠（河南省實驗動物中心 SCXK（豫） 2010-0002），PBS緩沖液，4%多聚甲醛固定液，一抗BMP2/4，電熱恒溫水槽等。

1.2實驗分組及脊髓損傷動物模型的建立 將60只體質(zhì)量200~250 g的SPF級SD大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組、模型組、治療組，雌雄各半，每組20只。假手術(shù)組大鼠造模時只打開胸10節(jié)段椎板，不損傷脊髓；模型組和治療組大鼠采用改良Allen垂直打擊法制作胸10節(jié)段脊髓損傷模型，打擊高度5 mm，重量10 g，直徑2 mm，打擊后保持打擊探頭壓迫脊髓30 S。造模成功的標志是大鼠硬脊膜無破裂，打擊節(jié)段脊髓迅速充血、水腫，尾巴痙攣性擺動，針刺后肢足底無反射性肌肉收縮。

1.3術(shù)后護理及干預(yù)措施 術(shù)后各組大鼠分籠飼養(yǎng)，常規(guī)肛門及會陰部護理。治療組大鼠于術(shù)后次日分別在每日早晚8時用BYHWT濃縮液（BYHWT原方水煎至95 ml制成相當于含生藥1.5 g/ml的水煎劑）灌胃，每次灌胃劑量按“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算臨床等效劑量，按60 kg體重人每天l劑換算，200 g大鼠等效用藥劑量為4.34 g，連續(xù)灌胃28天。

1.4B B B評分及w e s t e r n b l o t檢測 分別于造模前、造模后當天、造模后7天、造模后14天、造模后28天評估每只實驗大鼠的BBB評分；并于造模后28天取各組大鼠胸10節(jié)段脊髓組織，用4%多聚甲醛行左心室灌注后以損傷節(jié)段為中心取長約1cm的脊髓組織，經(jīng)PBS溶液漂洗3次后，經(jīng)破碎、勻漿、提取、沉淀處理，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，固定后與BMP2/4抗體雜交以顯色底物。

2 結(jié)果

造模后死亡大鼠及時補充，至取標本時必須保證每組樣本量為20。BBB評分數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，用Quantity One軟件分析條帶的灰度值。各組大鼠造模前BBB評分均為21分，具有可比性，造模后各個觀察點BBB評分經(jīng)統(tǒng)計分析，結(jié)果如下表：

表1三組大鼠造模后B B B評分 ，n=6 0）

表1三組大鼠造模后B B B評分 ，n=6 0）

注：造模后當天：假手術(shù)組B B B評分略低于造模前，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.0 5）；治療組和模型組B B B評分均明顯低于造模前，P<0.0 5（差異有統(tǒng)計學(xué)意義）；假手術(shù)組B B B評分明顯高于治療組和對照組，P<0.0 5；治療組與對照組B B B評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.0 5），具有可比性。造模后7天：假手術(shù)組B B B評分與造模后當天比較，P>0.0 5；治療組和模型組B B B評分均稍高于造模后當天，P>0.0 5；假手術(shù)組B B B評分。明顯高于治療組和對照組，P<0.0 5；治療組B B B評分略高于模型組，P>0.0 5。造模后1 4天：假手術(shù)組B B B評分與造模后7天比較，P>0.0 5；治療組和模型組B B B評分均稍高于造模后7天，差異無統(tǒng)P>0.0 5；治療組B B B評分高于模型組，P<0.0 5。造模后2 8天：假手術(shù)組B B B評分與造模后1 4天比較，P>0.0 5；治療組B B B評分高于造模后1 4天，P<0.0 5；模型組B B B評分略高于造模后1 4天，P>0.0 5；治療組B B B評分明顯高于模型組，P<0.0 5。

分組 當天 7天 1 4天 2 8天假手術(shù)組 1 9.0 1±0.3 9 1 9.3 9±0.5 5 1 9.5 1±0.2 3 1 9.6 9±0.1 9治療組 1.4 4±0.2 7 3.0 9±0.6 4 6.3 8±0.7 5 1 1.0 9±0.4 3模型組 1.3 9±0.3 0 1.4 1±0.5 1 2.9 3±0.6 14.8 5±0.5 1

圖2B MP 2/4western lot結(jié)果

3 討論

脊髓損傷后殘存軸突的脫髓鞘改變是SCI的常見病理改變之一。髓鞘是神經(jīng)系統(tǒng)特有的組織結(jié)構(gòu)，正常的髓鞘結(jié)構(gòu)對于神經(jīng)沖動快速傳導(dǎo)等方面有著重要的意義。因此如何使損傷的軸突重新獲得髓鞘化成為損傷軸突功能恢復(fù)的關(guān)鍵。OLs是CNS唯一的成鞘細胞，脊髓損傷后軸突脫髓鞘改變與OLs功能異常密切相關(guān)。SCI不僅導(dǎo)致大量神經(jīng)元丟失，同時還造成OLs死亡從而引起軸突脫髓鞘改變。本課題以O(shè)Ls為治療靶點，以促進殘存軸突再髓鞘化為治療方針，探討B(tài)YHWT對BMP2/4表達和活性的影響，從而進一步探討B(tài)YHWT對殘存軸突再髓鞘化的干預(yù)作用。BYHWT原方載于《醫(yī)林改錯》，具有補氣活血通絡(luò)的作用，對急性脊髓損傷氣滯血瘀證針對性很強。現(xiàn)代大量研究表明：BYHWT能有效營養(yǎng)神經(jīng)元細胞，可以明顯減少神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的死亡，促進神經(jīng)纖維的修復(fù)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)BMP在CNS發(fā)育中起著重要作用，在神經(jīng)發(fā)育的不同階段和CNS的不同區(qū)域調(diào)節(jié)細胞命運、增殖與分化。不同的BMP具有不同的功能 ，其中BMP2、4、7抑制神經(jīng)元及OLs生成 ，而誘導(dǎo)II星形膠質(zhì)細胞（Astrocyte，As） 的形成。少突膠質(zhì)前體細胞 （Oligodendrocyte precursor cells，OPCs） 屬于雙潛能干細胞，可以同時向OLs和IIAs兩個方向分化。脊髓損傷后損傷局部的As大量增殖，增殖的As大量表達BMP2/4，BMP2/4作用于OPCs，促進其向IIAs分化，擬制其向OLs分化，從而擬制了神經(jīng)軸突髓鞘的再生[3]。本課題以中藥BYHWT干預(yù)BMP2/4，發(fā)現(xiàn)BYHWT可以擬制BMP2/4的活性和表達，從而促進OLs的形成，擬制IIAs的形成，最終到達促進脊髓損傷后殘存軸突再髓鞘化的目的，同時也起到擬制膠質(zhì)瘢痕形成的作用。

BYHWT治療SCI療效確切，價格低廉，服用方便，副作用少，易于推廣，今后我們將繼續(xù)從細胞分子生物學(xué)方面探討B(tài)YHWT治療SCI的機制，為BYHWT的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

[1]王晗知，蔡文琴，肖嵐.少突膠質(zhì)細胞發(fā)育分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[J].生理科學(xué)進展，2 0 0 9，4:3 5 3-3 5 6.

[2]張繼平，王志彬，林愛華，等.補陽還五湯對脊髓損傷大鼠脊髓組織超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2 0 1 1，2:1 5 3-1 5 7.

[3]Wa n g Y.A s t r o c y t e s f r o mt h e c o n t u s e ds p i n a l c o r di n h i b i t o l i g o d e n d r o c y t e d i ff e r e n t i a t i o n o f a d u l t o l i g o d e n d r o c y t e p r e c u r s o r c e l l s b y i n c r e a s i n g t h e e x p r e s s i o n o f b o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n s[J].N e u r o s c i，2 0 1 1,3 1(1 6):6 0 5 3-6 0 5 8.