無償獻(xiàn)血者乙肝表面抗原弱陽性標(biāo)本不同檢測方法結(jié)果比較

程 穎,李 維，田耘博，程 燃(.重慶市血液中心檢驗科 40005；2.重慶市中山醫(yī)院 檢驗科 40004)

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·臨床探討·

無償獻(xiàn)血者乙肝表面抗原弱陽性標(biāo)本不同檢測方法結(jié)果比較

程 穎1,李 維1，田耘博1，程 燃2△(1.重慶市血液中心檢驗科 400015；2.重慶市中山醫(yī)院 檢驗科 400014)

目的 比較酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)、核酸檢測(NAT)共4種方法檢測乙肝表面抗原(HBsAg)弱陽性標(biāo)本的結(jié)果符合率，分析探討4種方法的特異性與靈敏度。方法 采用高靈敏度進(jìn)口和國產(chǎn)ELISA試劑對重慶地區(qū)2013年1～12月無償獻(xiàn)血標(biāo)本共116 351份進(jìn)行HBsAg血液定性篩查，選取0.8≤S/CO

乙型肝炎病毒表面抗原； 酶聯(lián)免疫吸附試驗； 膠體金免疫層析技術(shù)； 電化學(xué)發(fā)光免疫分析； 核酸檢測

流行病學(xué)調(diào)查顯示，乙肝病毒感染廣泛分布于世界各地。在某些成人感染者中，病毒具有自限性,但有5%～10%的感染者表現(xiàn)為慢性肝炎癥狀，導(dǎo)致肝臟嚴(yán)重?fù)p傷，最終導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[1]。因此，準(zhǔn)確判斷是否感染乙型肝炎顯得尤為重要。乙肝表面抗原(HBsAg)是各采供血機(jī)構(gòu)篩檢獻(xiàn)血者的必檢項目。我國現(xiàn)行的獻(xiàn)血法明確規(guī)定：為保證醫(yī)療臨床用血需要和安全，保障用血者身體健康，陽性標(biāo)本必須報廢，不得用于臨床。目前檢測HBsAg的主要方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)簡便、快速、特異、成本低、且靈敏度較高，特別適用于大批量獻(xiàn)血者篩查及健康體檢[2]。由于人感染病毒后，在血液檢測時存在檢測的窗口期，使得病毒陽性的獻(xiàn)血者存在一定的漏檢概率，因此將試劑盒陽性判定值(cut off)下一段區(qū)域20%設(shè)定為弱陽性。“弱陽性”指在定性ELISA測定中處于cut off值附近臨床意義可疑的一部分結(jié)果,對弱陽性標(biāo)本進(jìn)行初復(fù)檢雙孔重新測定，其初復(fù)檢標(biāo)本OD值仍為弱陽性的都視為陽性報廢，這樣也會造成很多“假陽性”的血液被報廢，使本身就缺血的重慶地區(qū)血液供應(yīng)更加緊張[3]。為了既保證不浪費(fèi)緊張的血液資源，又最大限度保障用血安全，作者選擇國內(nèi)常用的4種檢測方法對收集的HBsAg 弱陽性標(biāo)本進(jìn)行測定．并對結(jié)果進(jìn)行分析比較，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取重慶市血液中心2013年無償獻(xiàn)血標(biāo)本116 351份中抽取出的弱陽性標(biāo)本150份，每位獻(xiàn)血者留取5 mL和8 mL乙二胺四乙酸二鉀抗凝血各1管，無分離膠的用于ELISA檢測，有分離膠的用于核酸檢測(NAT)，各樣品管的離心和保存均按相應(yīng)的檢測試劑說明書要求進(jìn)行操作。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 深圳愛康Xantus全自動加樣儀；瑞士FAME24/20和FAME24/30全自動酶免分析儀；PROCI EIX TIGRIS核酸檢測系統(tǒng)(美國諾華)；RT-2100C酶標(biāo)儀及羅氏(Cobas)全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀；穿越信息管理系統(tǒng)軟件。

1.2.2 試劑 酶聯(lián)免疫試劑：ELISA試劑盒(生物梅里埃和北京萬泰)；膠體金試劑：膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)試紙條(艾康生物)；電化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑：電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)儀及其配套試劑(上海羅氏)；核酸試劑：乙型肝炎病毒核酸檢測(NAT)試劑盒(美國諾華)、HBsAg鑒別探針試劑。

1.3 檢測方法 將所有保存的弱陽性標(biāo)本復(fù)融后，分別以ELISA試劑盒、GICA試紙條、ECLIA、NAT平行檢測HBsAg。

1.3.1 ELISA法 獻(xiàn)血者標(biāo)本分別采用兩臺深圳愛康Xantus全自動加樣儀、兩種試劑同時進(jìn)行加樣，采用瑞士FAME24/20和FAME24/30全自動酶免分析儀進(jìn)行后處理檢測；采用海參威實驗室信息管理系統(tǒng)軟件接受處理檢測結(jié)果，本實驗室將弱陽性下限值設(shè)置為S/CO值=0.8，其中0.8≤S/CO<1.0設(shè)置為弱陽性,任意一種試劑S/CO≥0.8，均須用該試劑作雙孔復(fù)試，雙試劑S/CO≥0.8或單試劑雙孔復(fù)試至少一孔S/CO≥0.8即判為初篩呈反應(yīng)性，該標(biāo)本對應(yīng)的血液報廢。

1.3.2 GICA法 GICA在15 min和30 min各觀測1次結(jié)果，以后者為報告結(jié)果，測定結(jié)果應(yīng)在15 min內(nèi)讀取，30 min后判定無效。

1.3.3 ECLIA法 將待測標(biāo)本與生物素標(biāo)記的單克隆抗體、三氯聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]標(biāo)記單克隆抗體、鏈酶親和素標(biāo)記磁性微粒加入到反應(yīng)杯中共同溫育，形成磁性微珠包被抗體-抗原-發(fā)光劑標(biāo)記抗體復(fù)合物。將上述復(fù)合物吸人流動室，同時用電子供體三丙胺(TPA)緩沖液沖洗。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下的磁鐵吸引住，而游離的發(fā)光劑標(biāo)記抗體被沖走。同時在電極加電壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使發(fā)光試劑標(biāo)記物Ru(bpy)3和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測的乙肝表面抗原的濃度呈正比。

1.3.4 NAT法 NAT檢測與結(jié)果判斷采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)檢測技術(shù)進(jìn)行NAT檢測。標(biāo)本于生物安全柜內(nèi)開蓋，置于樣品架，按照全自動血液病毒核酸檢測儀(Procleix UI TRIO Systern)的操作程序上樣，進(jìn)行單人份NAT檢測。先用UI TRIO試劑在TIGRIS上做HIV RNA、HCV RNA、HBV DNA三聯(lián)檢測分析，對于UI TRIO有活性的標(biāo)本，判為NAT聯(lián)檢陽性；再分別進(jìn)行Procleix HIV、HCV 和HBV鑒別試驗(dHIV-1、dHCV 和dHBV)。

2 結(jié) 果

2.1 4種方法測定血清HBsAg弱陽性標(biāo)本的結(jié)果比較 見表1。

表1 4種方法測定血清HBsAg弱陽性標(biāo)本的結(jié)果比較(n)

2.2 以ECLIA為標(biāo)準(zhǔn)3種方法測定血清HBsAg的各診斷指標(biāo)比較 見表2。

表2 3種方法各診斷指標(biāo)比較(%)

3 討 論

HBsAg是一種22 nm的小球形顆粒，小球形顆粒是由100個HBsAg單體組成，乙肝患者血清中首先出現(xiàn)的病毒標(biāo)志物就是表面抗原HBsAg，所以HBsAg對于乙型肝炎疾病的早期診斷和普查具有很高價值[4]。由于ELISA的影響因素較多，常規(guī)檢測中存在著一些介于陰性和陽性之間的弱陽性結(jié)果，且弱陽性標(biāo)本日益增多,但對其沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)，從而造成血液制品的浪費(fèi)。HBsAg弱陽性出現(xiàn)的原因比較復(fù)雜，目前研究發(fā)現(xiàn)可能存在以下幾個方面原因[5-8]：(1)HBVS基因的變異導(dǎo)致HBsAg結(jié)構(gòu)及抗原性變異，使傳統(tǒng)檢測試劑靈敏度下降，出現(xiàn)假陰性或者弱陽性，而體內(nèi)HBsAg實際上仍處于相當(dāng)高的水平。(2)個體的免疫狀況存在差異，部分人群對HBV耐受，免疫應(yīng)答水平低，因此使得S基因表達(dá)較低，但是疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸卻并不理想，甚至個別患者會出現(xiàn)持續(xù)性的肝損傷，更應(yīng)引起臨床的重視。(3)不同的檢測方法、不同廠家的檢測試劑及檢測儀器和檢測環(huán)境的差異，對實驗結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。所以，弱陽性標(biāo)本檢測的準(zhǔn)確性，對于采供血部門的質(zhì)量管理來說是一個非常重要的控制點(diǎn)。

GICA是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，多用于無償獻(xiàn)血現(xiàn)場的首選篩查方法。目前，國產(chǎn)的乙肝表面抗原膠體金試紙條檢測靈敏度已達(dá)到1 ng/mL，但是膠體金試紙條在前端采血中還是很多的缺點(diǎn)：(1)多數(shù)的快速診斷試劑是定性的，只能用于檢測標(biāo)本中是否含有超過檢測濃度的特定生物成分存在，故它的靈敏度會受到一定限制和影響，在HBsAg檢測標(biāo)本濃度較低時易出現(xiàn)假陰性導(dǎo)致漏檢。(2)由于檢測結(jié)果是肉眼進(jìn)行判讀，較容易引起人為主觀判斷因素造成的差異。本實驗結(jié)果表明，GICA的靈敏性較ECLIA、ELISA、NAT低，是4種方法中靈敏度最低的，GICA適用于獻(xiàn)血前初篩檢測使用[9]。

ELISA是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù),是目前國內(nèi)檢測HBsAg的常規(guī)方法，其優(yōu)點(diǎn)在于快速、操作簡單、實驗設(shè)備要求簡單、應(yīng)用范圍廣泛、敏感性高、特異性強(qiáng)、無放射性污染、能定性及半微量、微量、超微量定量分析等，是目前發(fā)展比較快的酶免疫學(xué)技術(shù)方法。但ELISA檢測HBV血清標(biāo)志物的影響因素也非常多，受加樣、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、洗滌徹底性等諸多因素的影響[10]。國產(chǎn)試劑之間、國產(chǎn)試劑及進(jìn)口試劑與進(jìn)口試劑間在檢測質(zhì)量及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)上均存在一定的差異，這主要是抗原抗體反應(yīng)難于溯源及普遍存在的基質(zhì)效應(yīng)所造成，而且操作步驟繁瑣，整個實驗過程至少需要2 h左右，因此不適用于急診及無償獻(xiàn)血現(xiàn)場篩查。本研究結(jié)果顯示，ELISA法的靈敏度和特異性分別為90.2%和93.2%，比ECLIA略低，證明其還是存在漏檢風(fēng)險。研究分析ELISA漏檢的原因，主要集中在窗口期、靈敏度、罕見的亞型、變異及免疫靜默感染幾個方面，其中窗口期漏檢是影響血液安全性的主要問題[11-13]。

免疫測定技術(shù)發(fā)展一日千里，化學(xué)發(fā)光技術(shù)、時間分辨熒光技術(shù)和電化學(xué)發(fā)光技術(shù)在體外診斷技術(shù)中逐漸占據(jù)主流地位。ECLIA應(yīng)用較晚，但其發(fā)展卻很快[14]。ECLIA檢測HBsAg是目前世界上乙肝標(biāo)志物檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法兼具免疫學(xué)反應(yīng)和電化學(xué)發(fā)光的高特異性、靈敏性、精密度和準(zhǔn)確度等優(yōu)點(diǎn)，其測定結(jié)果較其他方法更穩(wěn)定，線性范圍寬，抗干擾能力強(qiáng)，重復(fù)性好，并可單份檢測，檢測時間短，體現(xiàn)了ECLIA在方法學(xué)上的優(yōu)勢及在臨床診斷上的重要價值[15]。本文的實驗結(jié)果證實ECLIA法檢測HBsAg弱陽性標(biāo)本的靈敏性優(yōu)于ELISA法、GICA法、NAT試驗，是4種方法中靈敏性最高的。但因為儀器昂貴、試劑成本較高等因素，僅用于針對弱陽性標(biāo)本的檢測。

據(jù)資料文獻(xiàn)顯示，我國HBV感染者中，存在一部分血清HBsAg呈低水平狀態(tài)的個體，NAT能夠降低輸血?dú)堄囡L(fēng)險，保證輸血安全[16]。國內(nèi)也有不少血液中心開始使用NAT技術(shù)應(yīng)用于獻(xiàn)血者血液篩查。NAT包含多種直接檢測病原體核酸的方法，其中我國各血液中心最常用血液篩查NAT方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和TMA[17-18]。NAT靈敏度與特異性高，在病毒感染數(shù)天后即能檢出，可明顯縮短病毒感染的“窗口期”，可有效彌補(bǔ)其他檢測方法中存在的“窗口期”較長，病毒滴度、病毒變異、免疫沉默性感染和人為因素等原因而造成的漏檢[19]。NAT檢測與其他血清學(xué)方法相比較要求更嚴(yán)格：(1)試劑應(yīng)具有較高的靈敏性、重復(fù)性、特異性；(2)實驗室環(huán)境、設(shè)備要求更高。(3)標(biāo)本留樣和處理要求更高，因此NAT檢測得成本也較高。初步研究表明，ELISA檢測HBV“窗口期”約為45～55 d，采用混合標(biāo)本NAT檢測，“窗口期”將縮短9 d。采用單人份NAT檢測，“窗口期”將縮短30 d[20]。NAT檢測最大的優(yōu)勢在于可以縮減獻(xiàn)血者“窗口期”，減少受血者通過輸血途徑感染病毒的風(fēng)險，但也不可避免有漏檢標(biāo)本出現(xiàn)。NAT與ELISA所應(yīng)用的檢測原理和檢測方法存在一定差異，NAT檢測的對象是病毒核酸，而ELISA檢測的對象是抗原或抗體，2種方法在檢測血液標(biāo)本過程中存在一定的互補(bǔ)性，ELISA由于試劑、環(huán)境、設(shè)備等因素存在假陽性的可能；當(dāng)獻(xiàn)血者血液中病毒載量低于NAT的檢出水平或病毒處在靜默期時，導(dǎo)致NAT出現(xiàn)假陰性。病毒由于長期存在于機(jī)體中，將會感染導(dǎo)致血液中抗體或抗原滴度相當(dāng)高，雖然不會影響到ELISA的檢測，但血液中存在的HBsAg是由病毒DNA整合到人染色體與宿主基因共同表達(dá)所致，因此無法檢測到血清中病毒HBV DNA，造成NAT漏檢?，F(xiàn)階段，國內(nèi)大多數(shù)血站針對血液篩查呈陽性或弱陽性的標(biāo)本，幾乎都未開展確證試驗，假陽性率過高不僅導(dǎo)致血液制品的浪費(fèi)，同時也對獻(xiàn)血者的心理造成一定壓力，采供血機(jī)構(gòu)在履行告知義務(wù)時感到十分尷尬，獻(xiàn)血者對血站檢測質(zhì)量甚至對血站整體能力產(chǎn)生懷疑，給獻(xiàn)血者招募帶來負(fù)面影響，直接導(dǎo)致固定低危獻(xiàn)血者的流失，給無償獻(xiàn)血事業(yè)的可持續(xù)發(fā)展帶來嚴(yán)重影響。

綜上所述，以上4種檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，又具有一定互補(bǔ)性。GICA初篩測定弱陽性的標(biāo)本需用ELISA進(jìn)行雙孔復(fù)檢，同時也可以用ECLIA復(fù)查；目前檢測HBsAg應(yīng)用最為廣泛的方法是ELISA，因為其靈敏度、特異性較高且成本低廉，適合大批量標(biāo)本檢測，但ELISA得影響因素諸多，檢測假陽性較高已無法適應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)高速發(fā)展的步伐?，F(xiàn)階段隨著免疫學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，速度更快、成本更低的新一代檢測方法不斷推出，使HBsAg滴度表達(dá)很低的標(biāo)本得以檢出，最大限度地滿足定量檢測的要求。NAT與ELISA血液篩查檢測互補(bǔ)作用主要體現(xiàn)在3個方面：(1)窗口期漏檢是目前ELISA漏檢的最大因素。(2)以抗原抗體免疫反應(yīng)技術(shù)基礎(chǔ)的ELISA方法對免疫靜默感染、病毒變異、病毒亞型檢測性能低。(3)ELISA檢測“弱陽性”的設(shè)置在理論上可以改善試劑檢測靈敏度低所造成的漏檢現(xiàn)象，卻依然無法改變因病毒變異、病毒亞型或“窗口期”而造成的漏檢。因此，采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)合理開展多種方法聯(lián)合檢測，建立更科學(xué)的血液病原學(xué)篩查模式，最大限度降低血液制品不合理淘汰和資源浪費(fèi)，降低輸血傳播疾病的風(fēng)險。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.060

A

1672-9455(2015)16-2444-03

2015-02-28

2015-04-10)

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