Cx30.2和Cx45在急性心肌梗死大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中的表達(dá)

顧國萍 張麗華

1.鄭州市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南鄭州450004; 2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南鄭州450014

Cx30.2和Cx45在急性心肌梗死大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中的表達(dá)

顧國萍1張麗華2▲

1.鄭州市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南鄭州450004; 2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南鄭州450014

目的探討急性心肌梗死大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中連接蛋白(Cx30.2、Cx45)的表達(dá)。方法結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支建立急性心肌梗死模型，隨機(jī)分為模型組(MI組，n=10)和假手術(shù)組(只穿線不結(jié)扎，SH組，n=10)。術(shù)后4周取心臟標(biāo)本，采用免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果術(shù)后4周MI組Cx30.2和Cx45蛋白表達(dá)增加，分布不均，無規(guī)則，與SH組相比，蛋白表達(dá)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00);Cx30.2和Cx45 mRNA在MI組的表達(dá)量亦增加，與SH組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00);Cx30.2和Cx45 mRNA的表達(dá)具有明顯正相關(guān)(r=0.938，P＜0.05)。結(jié)論急性心肌梗死后心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45表達(dá)增加，二者mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。

急性心肌梗死;連接蛋白30.2;連接蛋白45;免疫組化;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)因心肌缺血缺氧及缺血-再灌注損傷等可引起包括心律失常、心泵功能衰竭和心臟機(jī)械結(jié)構(gòu)破壞等多種并發(fā)癥，其中，心律失常是影響患者預(yù)后和生活質(zhì)量的重要因素之一，其發(fā)生機(jī)制尚不明確。國內(nèi)外大量研究認(rèn)為，多種機(jī)制參與了心律失常的發(fā)生及維持，如氧自由基的大量生成、Ca2+超載和細(xì)胞內(nèi)酸性物質(zhì)堆積等。隨著對心律失常研究的深入，目前認(rèn)為心肌細(xì)胞閏盤間縫隙連接的改變和心律失常的發(fā)生密切相關(guān)，是心律失常發(fā)生和維持的物質(zhì)基礎(chǔ)［1-3］。

縫隙連接(gap junction，GJ)介導(dǎo)著相鄰細(xì)胞間離子、小分子代謝物和信號分子(包括第二信使，如Ca2+、IP3、cAMP、cGMP等)的直接擴(kuò)散，進(jìn)而構(gòu)成相鄰細(xì)胞間電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使兩個相鄰細(xì)胞的細(xì)胞漿能夠進(jìn)行直接交換?？p隙連接由連接蛋白(connexins，Cxs)構(gòu)成，它的作用是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間電和生物化學(xué)信號的傳遞，為電興奮的順序傳播構(gòu)成細(xì)胞間的通路而調(diào)控心肌細(xì)胞的同步收縮。連接蛋白表達(dá)與分布的異常將導(dǎo)致相應(yīng)傳導(dǎo)速度和各向異性傳導(dǎo)發(fā)生變化，從而形成引起心律失常的環(huán)路。在大鼠的基因組中已經(jīng)確認(rèn)有20種連接蛋白基因［4］。每種Cxs都有其特定的表達(dá)區(qū)域，發(fā)揮著特異的功能，在心臟結(jié)區(qū)組織中表達(dá)的連接蛋白有Cx30.2和Cx45，發(fā)揮房室傳導(dǎo)延遲的作用，進(jìn)而保證心房、心室的同步有序收縮，目前尚未見到在動物模型中二者表達(dá)變化的研究。本研究通過急性心肌梗死模型的建立，探討大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HX-100E小動物呼吸機(jī)，成都泰蒙科技有限公司;ASB240U生物信號采集分析系統(tǒng)，成都遨生電子有限公司;兔抗Cx30.2單克隆抗體(編號40-7400)，Invitrogen公司;兔抗Cx45單克隆抗體，美國Santa公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司;Cx30.2、Cx45和GAPDH(內(nèi)參)引物，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;基因擴(kuò)增儀，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司;DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 模型制備及動物分組

選擇SPF級SD大鼠(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號410118)，體重200～250 g，隨機(jī)分為模型組(MI組，n=10)與假手術(shù)組(SH組，n=10)。MI組:SD大鼠稱重后，用10%的水合氯醛溶液以300 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，將大鼠背部固定在大鼠板上，備皮，消毒，連接多道生理信號采集處理系統(tǒng)，肢體導(dǎo)聯(lián)根據(jù)人體的傳統(tǒng)部位安放電極，用針電極刺入四肢皮下，監(jiān)測心電圖(electrocardiogram，ECG)。經(jīng)口氣管插管后接小動物呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率為50～60次/min，潮氣量為3 mL/min，呼吸比3∶2。于胸骨左緣打開胸腔，破開心包，暴露心臟，以左冠狀靜脈為標(biāo)志，距主動脈根部2～3 mm處用6-0無創(chuàng)傷縫線穿過冠狀動脈左前降支(left anterior descending，LAD)并結(jié)扎。結(jié)扎后遠(yuǎn)端局部心肌由鮮紅色變?yōu)榘导t色，隨后蒼白搏動減弱，ECG示Ⅰ、aVL導(dǎo)聯(lián)J點(diǎn)偏移抬高，ST段抬高作為急性心肌梗死模型成功建立的標(biāo)志(ECG以標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行心電參數(shù)測量［5］)。檢查無出血時間斷縫合肋骨層，并抽出胸腔內(nèi)氣體恢復(fù)胸腔負(fù)壓后逐層關(guān)胸。待大鼠出現(xiàn)自主呼吸拔出氣管插管。術(shù)后肌注青霉素40萬U/d，連用3 d預(yù)防感染。SH組于LAD下只穿線不結(jié)扎，余操作同模型組［6］。

1.3 取材

術(shù)后4周處死大鼠并迅速取出心臟，在兩組大鼠心臟結(jié)區(qū)垂直于心臟長軸分別切取兩塊厚度為3～4 mm的心肌組織作為標(biāo)本，一塊放入10%的中性福爾馬林溶液中，24 h后常規(guī)固定脫水、石蠟包埋，用于制備免疫組化樣品;另一塊迅速放入液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱用于提取RNA。

1.4 免疫組化法檢測大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白表達(dá)

免疫組化采用SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，DAB顯色。用已知陽性切片做陽性對照，0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)

嚴(yán)格按照試劑盒說明提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察電泳結(jié)果并照相。用Quantity One軟件分析Cx30.2和Cx45條帶的灰度值，并以Rat GAPDH灰度值為標(biāo)準(zhǔn)校正，確定Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)的相對含量。PCR擴(kuò)增基因引物序列及擴(kuò)增條件，見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn);Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性心肌梗死模型建立成功的心電圖標(biāo)志

結(jié)扎LAD后10 min，ECG監(jiān)測顯示Ⅰ、aVL導(dǎo)聯(lián)J點(diǎn)偏移抬高，ST段抬高，初步說明大鼠急性心肌梗死動物模型建立成功。術(shù)后4周處死大鼠時描記ECG示，相應(yīng)肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)病理性Q波，伴R波振幅減低。見圖1。

2.2 免疫組化法檢測心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白表達(dá)情況

光鏡下見SH組心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白有少量表達(dá)，為棕黃色規(guī)律條帶狀分布;Cx30.2和Cx45蛋白在MI組表達(dá)增加，分布不均，無規(guī)則。分析結(jié)果顯示:與SH組相比，MI組Cx30.2和Cx45蛋白表達(dá)的平均光密度增強(qiáng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。見圖2(封三)、表2。

2.3 RT-PCR法檢測心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)情況

Cx30.2和Cx45 mRNA灰度值的變化趨勢是一致的，在急性心肌梗死時表達(dá)增加，見圖3。分析發(fā)現(xiàn):與SH組相比，MI組Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)的灰度值增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，見表2。Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)相關(guān)性分析結(jié)果顯示: Cx30.2和Cx45 mRNA的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.938，P＜0.05)，回歸方程為y=0.833x+0.016。見圖4。

3 討論

心臟的正常激動起源于竇房結(jié)，沿著特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)(special conduction system，SCS)傳導(dǎo)至心房和心室，最后引起心房肌和心室肌細(xì)胞的同步收縮。而縫隙連接介導(dǎo)心肌細(xì)胞間電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)，為電興奮的順序傳播構(gòu)成細(xì)胞間的通路進(jìn)而調(diào)控心肌細(xì)胞的同步收縮。心臟的正常節(jié)律基本上是依賴于通過縫隙連接偶聯(lián)的心肌細(xì)胞。心臟正常節(jié)律的紊亂(心律失常)是很多心臟疾病(如急性心肌梗死、心力衰竭等)常見的、嚴(yán)重的甚至是致命的并發(fā)癥。細(xì)胞膜的異常導(dǎo)致動作電位的改變在心律失常的發(fā)生中起重要作用，但是目前認(rèn)為縫隙連接及其構(gòu)成成分縫隙連接蛋白也起重要作用［7］。AMI后可以發(fā)生各種心律失常，包括緩慢性和快速性心律失常，甚至致命性心律失常，因此對AMI后縫隙連接蛋白的研究極為重要。既往對AMI后縫隙連接蛋白的研究集中在AMI后心室肌梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)Cx43及Cx45表達(dá)的變化，作為心臟結(jié)區(qū)組織中主要縫隙連接蛋白的Cx30.2和Cx45的研究主要在基因和細(xì)胞水平，尚未見到在動物模型的心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45表達(dá)變化的研究。

表2 兩組Cx30.2、Cx45蛋白及mRNA表達(dá)情況比較(±s)

組別只數(shù)C x 3 0 . 2蛋白表達(dá)m R N A表達(dá)C x 4 5蛋白表達(dá)m R N A表達(dá)S H組M I組1 0 1 0 t值P值0 . 1 1 1 ± 0 . 0 1 5 0 . 4 0 4 ± 0 . 0 2 3 3 3 . 6 8 0 . 0 0 0 . 1 4 4 ± 0 . 0 2 3 0 . 4 9 1 ± 0 . 0 5 8 2 0 . 0 4 0 . 0 0 0 . 1 1 9 ± 0 . 0 1 4 0 . 2 5 9 ± 0 . 0 1 9 1 8 . 8 9 0 . 0 0 0 . 2 6 4 ± 0 . 0 2 9 0 . 4 9 8 ± 0 . 0 5 4 1 1 . 9 8 0 . 0 0

激動產(chǎn)生的心肌細(xì)胞及傳導(dǎo)系統(tǒng)的心肌細(xì)胞和心房、心室的收縮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)甚至細(xì)胞間縫隙連接蛋白的表達(dá)分布上都有顯著的不同［8-9］。Cx30.2主要表達(dá)在大鼠的竇房結(jié)和房室結(jié)等心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中，研究發(fā)現(xiàn)，在Hela細(xì)胞中其構(gòu)成的縫隙連接通道的電導(dǎo)性是所有縫隙連接通道中最低的(9pS)。Kreuzberg等［1］研究證實(shí)，Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的PQ間期比野生型同窩出生大鼠的PQ間期縮短了25%左右，應(yīng)用心內(nèi)電極記錄心房、希氏束及心室的電信號結(jié)果顯示: Cx30.2LacZ/LacZ型大鼠從心房到希氏束的傳導(dǎo)速度比Cx30.2+/+型大鼠明顯加快，心房和希氏束間期分別為(27.9±5.1)ms與(37.1±4.1)ms，而希氏束到心室的傳導(dǎo)速度沒有發(fā)生改變;另外，通過刺激Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的心房誘導(dǎo)了房顫的發(fā)生，揭示Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的房室結(jié)傳導(dǎo)加快和心室應(yīng)答率增加，進(jìn)而表明Cx30.2在減慢房室結(jié)沖動傳播中發(fā)揮作用，且限制從心房傳導(dǎo)到心室的最大心搏頻率;對心房、心室的同步收縮發(fā)揮一定的作用，并在房性心動過速等病理生理情況下阻止快速沖動向心室的傳播而發(fā)揮保護(hù)作用，進(jìn)而減少血流動力學(xué)的惡化。敲除Cx30.2基因的大鼠顯示，PQ間期縮短，表明Cx30.2延長房室傳導(dǎo)，其縮短房室傳導(dǎo)延遲時間是由于縮短AH間期而不是HV間期。通過研究經(jīng)基因敲除減少Cx30.2表達(dá)量的大鼠發(fā)現(xiàn)其房室結(jié)傳導(dǎo)速度加快。竇房結(jié)和房室結(jié)的細(xì)胞特異性表達(dá)少量的Cx45，在大鼠還表達(dá)有Cx30.2，這些縫隙連接蛋白在體外構(gòu)成低電導(dǎo)性的縫隙連接通道［10-11］。Cx30.2和Cx45在房室結(jié)的偶聯(lián)相對較少，這在房室結(jié)延遲傳導(dǎo)中起重要作用，進(jìn)而保證心室肌細(xì)胞的有序收縮。

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)組成了心肌細(xì)胞間電偶聯(lián)的特殊通道，該通道協(xié)調(diào)著整個心臟的沖動傳播，它的異常導(dǎo)致各種形式的心律失常［12］。竇房結(jié)和房室結(jié)是哺乳動物心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分，是控制與協(xié)調(diào)心臟電活動的中心，進(jìn)而有序地協(xié)調(diào)著心房和心室的順序收縮。在竇房結(jié)和房室結(jié)的心肌細(xì)胞表達(dá)有Cx30.2和Cx45，這些Cxs在體外構(gòu)成低電導(dǎo)性的縫隙連接通道，且在房室結(jié)的偶聯(lián)相當(dāng)較少，這使其發(fā)揮房室結(jié)延遲傳導(dǎo)的作用［11，13］。在房室結(jié)縫隙連接蛋白的表達(dá)是復(fù)雜的，某些區(qū)域由不同的縫隙連接蛋白共同表達(dá)，如兔子房室結(jié)三維結(jié)構(gòu)顯示:在結(jié)區(qū)和移行細(xì)胞主要表達(dá)Cx45，而在希氏束、結(jié)后細(xì)胞及結(jié)后延伸細(xì)胞共同表達(dá)Cx45和Cx43［14］。故在竇房結(jié)功能失調(diào)時，房室結(jié)延遲房室沖動傳播的作用可以保護(hù)心室免受快速心房率(比如房顫)的影響，另外房室結(jié)可作為潛在的起搏點(diǎn)控制心室的節(jié)律。通過基因敲除Cx30.2大鼠的試驗(yàn)進(jìn)一步揭示了Cx30.2在心臟的正常房室延遲傳導(dǎo)中是必需的［1］。Nikhil等［15］研究發(fā)現(xiàn)，Cx30.2和Cx40分別在房室傳導(dǎo)的慢傳導(dǎo)和快傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，而Cx45對Cx30.2和Cx40基因雙敲除大鼠擁有正常PR間期有重要的調(diào)控作用。在轉(zhuǎn)基因大鼠體內(nèi)，Cx45過表達(dá)導(dǎo)致了室性心律失常易感性的增加及細(xì)胞間偶聯(lián)的改變［16］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性心肌梗死后大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白的表達(dá)顯著增加，與SH組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，且分布紊亂不規(guī)律，這可能會影響心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45的偶聯(lián);急性心肌梗死后心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)較SH組亦明顯增高，且二者的表達(dá)變化呈正相關(guān)。提示Cx30.2和Cx45表達(dá)水平的異常升高可能與急性心肌梗死后易發(fā)室性心律失常有關(guān)。通過電壓膜片鉗技術(shù)對人類在體及鼠類離體心肌細(xì)胞縫隙連接通道電導(dǎo)的影響及轉(zhuǎn)染了Cx45的HeLa細(xì)胞的研究證實(shí)，抗心律失常肽AAP10及其衍生物ZP123對Cx45產(chǎn)生影響進(jìn)而發(fā)揮抗心律失常作用［17］。故需要對急性心肌梗死后縫隙連接蛋白的表達(dá)及改善縫隙連接蛋白表達(dá)進(jìn)行深入的研究。

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Expression of Connexin30.2 and Connexin45 in heart tissues of rats with acute myocardial infarction

GU Guoping1ZHANG Lihua2▲1.Department of Vasculocardiolody，the First People’s Hospital of Zhengzhou City，He’nan Province，Zhengzhou 450004，China；2.Department of Vasculocardiolody，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，He’nan Province，Zhengzhou450014，China

Objective To explore the expression of connexin30.2(Cx30.2)and connexin45(Cx45)in heart node area tissues of rats with acute myocardial infarction.Methods Via the ligation of the left coronary artery on rats，acute myocardial infarction models were built and randomly divided into two groups:the acute myocardial infarction model group(group MI，n=10)and the sham-operation group(group SH，n=10).Heart samples were extracted from rats 4 weeks after operation.The expression of Cx30.2 and Cx45 protein and mRNA in heart node area tissues was detected by immunohistochemistry and RT-PCR respectively.Results 4 weeks after operation，the expression of Cx30.2 and Cx45 protein increased in group MI，but scattered in disorder，compared with group SH，the differences of protein expression were statistically significant(P=0.00).The expression of Cx30.2 and Cx45 mRNA increased in group MI，compared with group SH，the differences were statistically significant(P=0.00).The expression of Cx30.2 mRNA was positively correlated with Cx45 mRNA(r=0.938，P＜0.05).Conclusion The expression of Cx30.2 and Cx45 protein and mRNA in heart node area tissues increase after acute myocardial infarction，and they are positively correlated.

Acute myocardial infarction；Connexin30.2(Cx30.2)；Connexin45(Cx45)；Immunohistochemistry；RT-PCR

R542.2

A

1673-7210(2015)02(c)-0022-05

2014-10-28本文編輯:程銘)

▲通訊作者