香格里拉地區(qū)山脈土壤微生物分布及藥敏結(jié)果

子建文，資云海，唐 輝，李 倩，張勝梅，李曉霞

高原地區(qū)土壤微生物分布已有報道，但云南高海拔地區(qū)土壤微生物調(diào)查報道較少，本研究對香格里拉地區(qū)遠離農(nóng)戶、人群、農(nóng)牧場的山脈土壤微生物的分布和藥敏情況進行了調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣地選擇 2014 年11 月中旬于香格里拉，樣地均為由稀疏灌木叢覆蓋的山坡地，且遠離農(nóng)戶、人群、牧場10 km 以上，在香格里拉縣城的東南西北方向20 km 以外分別設(shè)置具有代表性的1、2、3 和4 號采樣點，經(jīng)緯度分別是99°10′27″E27°29′18″N、99°24′31″E27°36′25″N、99°31′16″E27°32′9″N 和99°42′4″E27°49′2″N，海拔分別為3312、3185、3489 和3289 m，每個點分為陽坡和陰坡。

1.2 標本采集 按隨機布點法[1]，在每個采樣點的陽坡和其對應(yīng)的陰坡分別以“Z”字型選取4 個點，除去地面植被和枯枝落葉，鏟除1 cm 左右的表土，挖好剖面后，燒灼法消毒取樣鏟，取深度為30 cm 的黃土，需氧標本放于無菌均質(zhì)袋中，厭氧標本放入無菌厭氧袋內(nèi)，標記后密封運送。 無菌均質(zhì)袋由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 需氧菌與真菌 稱取10 g 新鮮土壤，加入盛100 ml無菌水的500 ml 三角瓶內(nèi)，振蕩10 min，使土壤均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液，吸取1 ml 土懸液到9 ml 無菌水中，按10 倍法依次稀釋，真菌稀釋105倍，細菌稀釋106倍。 取稀釋好的菌液傾注3 塊血平板(1 ml/塊)，置于37 ℃溫箱孵育48 h；真菌傾注3 塊沙氏培養(yǎng)基(1 ml/塊)，置于25 ℃溫箱孵育72 h，然后計數(shù)菌落，計算出土壤中微生物數(shù)量。 觀察平板上的菌落形態(tài)、顏色。 對生長的細菌進行革蘭染色，用TREK DLAGNOSTIC SYSTEMS LTD 全自動微生物鑒定儀（賽默飛世爾科技公司）進行細菌鑒定。 真菌鑒定根據(jù)肉眼觀察在沙氏培養(yǎng)基上生長形態(tài)及顯微鏡觀察真菌孢子形態(tài)。將性狀相同的菌類進行歸類。藥敏試驗采用美國臨床試驗室標準化研究所（CLSI）推薦的K-B 法，藥敏紙片由貝瑞特生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)提供。

1.3.2 厭氧菌 將標本接種于9.0 cm 直徑的厭氧培養(yǎng)基中，置于35 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用法國梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK 2 系統(tǒng)及其配套的測試卡進行鑒定和藥敏試驗。

1.4 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC-25922、 銅綠假單胞菌ATCC-27853、金黃色葡萄球菌ATCC-25923，購自云南省臨床檢驗中心。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件包分析數(shù)據(jù)，WHonet 5 軟件包對藥敏資料進行分析。 不同采樣點的陰坡或陽坡微生物數(shù)量之間比較用方差分析，同一采樣點的陽坡和陰坡之間比較用獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各采樣點微生物分布 4 個采樣點陽坡的細菌總數(shù)和真菌總數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），陰坡之間的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），但4 個采樣點的陽坡與陰坡的微生物總數(shù)均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜0.05），即細菌（或真菌）總數(shù)陰坡＞陽坡（見圖1、2）。

2.2 各采樣點微生物構(gòu)成 各種細菌或真菌在不同采樣點的構(gòu)成比無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞0.05）；各采樣點的厭氧菌構(gòu)成比無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞0.05），但革蘭陰性菌、革蘭陽性菌及真菌構(gòu)成比有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜0.05），革蘭陰性菌＞革蘭陽性菌＞厭氧菌＞真菌（表1）。

圖1 各采樣點陰陽面土壤中細菌數(shù)均值

圖2 各采樣點陰陽面土壤中真菌數(shù)均值

表1 香格里拉不同采樣點土壤中微生物構(gòu)成[株(%)]

表2 香格里拉土壤中革蘭陰性菌對常用抗生素藥物的敏感率[株（%）]

表3 香格里拉土壤中革蘭陽性菌對常用抗生素藥物的敏感率[株(%)]

表4 香格里拉土壤中厭氧菌對常用抗生素藥物的敏感率[株(%)]

表5 香格里拉土壤中真菌對藥物的敏感率[株(%)]

2.3 革蘭陰性菌藥敏試驗 氨基糖苷類和半合成青霉素類抗生素敏感率較高，除嗜水氣單孢菌對阿米卡星敏感率為85.7%外，其余均為100.0%；喹諾酮類中，左氧氟沙星對所鑒定的細菌全敏感， 其余細菌敏感性在75.3%～100.0%之間。頭孢菌素中，革蘭陰性菌對頭孢哌酮/舒巴坦敏感率100.0%；其次是頭孢噻吩和頭孢唑啉，敏感率大于85.7%； 除銅綠假單胞菌和棲稻黃色單胞菌敏感率介于76.5%～82.9%外，其余細菌對頭孢曲松和頭孢呋辛鈉敏感率均為100.0%； 而銅綠假單胞菌和棲稻黃色單胞菌對頭孢西丁敏感率100.0%， 其余細菌敏感率介于52.4%～56.5%之間。 革蘭陰性菌對碳青霉烯類敏感率51.8%～100.0%。 棲稻黃色單胞菌和嗜水氣單孢菌對復(fù)方新諾明敏感率100.0%，其余細菌敏感率介于75.9%～96%之間。嗜水氣單胞菌、 豚鼠氣單胞菌和河流弧菌對氨曲南敏感性100.0%，其余細菌介于50.6%～57.3%之間。 見表2。

2.4 革蘭陽性菌藥敏試驗 所分離得到的革蘭陽性菌對青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素、妥布霉素、阿米卡星和萬古霉素普遍敏感，敏感率在97.4%以上；腐生葡萄球菌對所有抗生素敏感，未發(fā)現(xiàn)耐藥株。 見表3。

2.5 厭氧菌藥敏試驗 分離出的4 種厭氧菌對常用抗生素的敏感率在90.9%以上。 除壞名梭菌對氯霉素和青霉素敏感率為90.9%外，其余敏感率均為100.0%。 見表4。

2.6 真菌藥敏試驗 合成類抗生素、伏立康唑及伊曲康唑?qū)? 種真菌全覆蓋， 敏感率均為100.0%。 真菌對克霉唑、特比萘芬的敏感率在90.0%以上。 見表5。

3 討論

高海拔地區(qū)具有獨特的自然地理環(huán)境，其主要特征是高寒、缺氧、日照時間長，輻射強，降水較少，相對干燥[2]。該區(qū)域山脈陰陽坡面在日照輻射、相對溫濕度等方面差異顯著，造成區(qū)域內(nèi)微生物數(shù)量分布差異[3-5]。本試驗結(jié)果表明，香格里拉高海拔山脈陰坡面土壤中微生物數(shù)量大于陽坡。香格里拉高海拔山坡地域因其獨特的高原自然地理環(huán)境和人文環(huán)境，土壤污染小，土壤微生物數(shù)量明顯低于其他低海拔地區(qū)。

該區(qū)域4 個采樣點土壤微生物數(shù)量及構(gòu)成比之間無顯著差異， 各點土壤中微生物以細菌為主， 平均占96.54%，真菌數(shù)量較少，平均占3.46%。細菌中革蘭陰性菌數(shù)量多于革蘭陽性菌；革蘭陰性菌中優(yōu)勢菌為痢疾志賀菌（8.54%）、 棲稻黃色單胞菌 （8.16%）、 銅綠假單胞菌（7.87%）和侵肺巴斯德菌（7.97%），革蘭陽性菌中優(yōu)勢菌為腐生葡萄球菌（14.59%）、蠟樣芽胞桿菌（14.59%）和蘇云金芽孢桿菌（8.54%）。

該區(qū)域土壤中微生物藥敏試驗結(jié)果表明，香格里拉高海拔山脈坡面土壤中細菌、 真菌對絕大多數(shù)抗生素敏感，高海拔山地環(huán)境中土壤微生物對常用抗生素的敏感性較低海拔地區(qū)高，其中厭氧菌僅檢出1 株耐氯霉素的壞名梭菌，其余菌株敏感率均為100%；但是也檢出對頭孢菌素、氨曲南及紅霉素等耐藥的菌株，說明長期廣泛使用此類抗生素，即使在遠離農(nóng)戶、人群、牧場的高海拔區(qū)域，也已有耐藥菌株的存在。

高海拔地區(qū)自然災(zāi)害和事故也時有發(fā)生，人員受傷不可避免，尤其是火器傷傷口創(chuàng)面可不同程度被空氣和土壤中的細菌污染，創(chuàng)面感染細菌的種類與受傷部位周邊存在的菌群有密切關(guān)系[6]，且感染以條件致病菌和耐藥菌株為多[7]。相關(guān)動物模型試驗表明，傷口早期感染細菌與所處環(huán)境細菌譜有交叉重疊[8]。 摸清此類地域土壤微生物本底狀況，為創(chuàng)傷感染細菌檢測和治療提供依據(jù)具有現(xiàn)實意義。

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