雞滑液囊支原體不同地區(qū)分離株對常用抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)

丁美娟，盧鳳英，嚴(yán)鵬，尹秀鳳，張小飛,2*

(1. 南京天邦生物科技有限公司，南京 211102；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京 210014)

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雞滑液囊支原體不同地區(qū)分離株對常用抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)

丁美娟1，盧鳳英1，嚴(yán)鵬1，尹秀鳳1，張小飛1,2*

(1. 南京天邦生物科技有限公司，南京 211102；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京 210014)

為調(diào)查不同地區(qū)雞滑液囊支原體的耐藥情況，從河南、江蘇、安徽、河北和廣東五省204份疑似雞滑液囊支原體感染雞的病料中分離到20株雞滑液囊支原體，每省隨機(jī)取1株進(jìn)行了12種常用抗菌藥物的敏感性測定。結(jié)果表明，5株雞滑液囊支原體均對泰樂菌素較為敏感，而對恩諾沙星、氧氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星具有不同程度的耐受性。本實(shí)驗(yàn)可為臨床合理用藥提供參考。

雞滑液囊支原體；分離鑒定；藥物敏感性試驗(yàn)

滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae, MS)可引致雞和火雞的傳染性滑液囊炎，可通過卵傳遞[1]。由于該病主要涉及關(guān)節(jié)的滑液囊及腱鞘，引起滑膜炎、腱鞘炎，一旦在雞群中感染很難根除。該病在雞群中長期蔓延，會(huì)導(dǎo)致飼料利用率低、生長發(fā)育遲緩、淘汰率增高、產(chǎn)蛋量下降等[2]。發(fā)病雞群抵抗力下降，易發(fā)生與其他病原體的混合感染，加劇病情，增加死亡率，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雞滑液囊支原體病的控制主要是通過疫苗免疫和藥物控制[3]兩種方法，到目前為止，僅澳大利亞等國家有商品化的MS滅活疫苗和弱毒疫苗應(yīng)用[4]，而我國養(yǎng)殖場主要靠抗菌藥物控制該病，但藥物防治效果不佳的情況越來明顯。本試驗(yàn)旨在調(diào)查各常規(guī)抗菌藥物對雞滑液囊支原體的耐藥性，為雞滑液囊支原體病臨床合理用藥提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 雞滑液囊支原體菌株及臨床病料的采集 標(biāo)準(zhǔn)株MS GX11-T株(批號：20060701)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；對2012-2014年從河南、江蘇、安徽、河北和廣東五省送檢的204份疑似雞滑液囊支原體感染的病雞，無菌采集其腫脹跗關(guān)節(jié)腔內(nèi)容物。

1.2 培養(yǎng)基 改良Frey氏液體培養(yǎng)基，南京天邦生物科技有限公司生物技術(shù)研究所提供。

1.3 主要試劑 MS陽性血清(批號：200501)、MG陽性血清(批號：200701)和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(批號：20071217)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；Taq酶，購自大連寶生物工程公司。

1.4 抗菌藥物 泰樂菌素(批號：1311140109)，大連三儀動(dòng)物藥品有限公司；紅霉素(批號：20130409)、氟苯尼考(批號：20130826)，南京福斯特牧業(yè)科技有限公司生產(chǎn)；替米考星(批號：201405011)、氧氟沙星(批號：201401003)，保定冀中藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；林可霉素(批號：20140103)，江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司；鹽酸土霉素(批號：20140218)，廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份公司；慶大霉素(批號：20140210)，天津嘉創(chuàng)生物科技有限公司；卡那霉素(批號：C9U131204)，河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司；環(huán)丙沙星(批號：20130102)，洛陽惠中獸藥有限公司；恩諾沙星(批號：20131101)，佛山市南海東方澳龍制藥有限公司；金霉素(批號：1013042006)，齊魯制藥(內(nèi)蒙古)有限公司。

2 方法

2.1 分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 對采集樣品進(jìn)行支原體分離培養(yǎng)，置37 ℃溫箱培養(yǎng)，待培養(yǎng)液變?yōu)辄S色時(shí)，接種到新的培養(yǎng)液中傳代，取培養(yǎng)物涂片，瑞氏染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)；另取傳3代后的液體培養(yǎng)物100 μL接種于改良Frey氏固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如果固體培養(yǎng)基上有菌落生長，置低倍顯微鏡下觀察中央凸起呈荷包蛋樣的菌落，進(jìn)一步做血清鑒定。

2.2 雞紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) 取5 mL 0.25%雞紅細(xì)胞懸液加入已培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)基表面，在室溫下作用20 min，棄去紅細(xì)胞懸液，用生理鹽水洗滌3次，在低倍顯微鏡下觀察，看菌落表面有無紅細(xì)胞吸附。

2.3 血清學(xué)試驗(yàn) 液體培養(yǎng)物37 ℃培養(yǎng)3代后，參照姜平[5]介紹的方法，離心濃縮進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)。

2.4 代謝抑制試驗(yàn) 在廖永洪等[6]方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)。在10支小管中分別加入1 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基,于第1支小管內(nèi)加入1 mL抗雞滑液囊支原體特異性血清，混勻后取1 mL于第2支小管，如此進(jìn)行2倍梯度稀釋至第8支小管，混勻后棄去1 mL。取對數(shù)生長期分離株培養(yǎng)物，用改良Frey氏液體培養(yǎng)基10000倍稀釋，在第1～9支小管內(nèi)分別加入1 mL稀釋培養(yǎng)物，第10支管內(nèi)加入1 mL抗雞滑液囊支原體特異性血清，置37 ℃培養(yǎng)。每天觀察培養(yǎng)液的顏色變化，當(dāng)菌液對照管顏色變黃時(shí)，小管中培養(yǎng)液顏色未變黃的血清最高稀釋度的倒數(shù)即為抑制價(jià)。取標(biāo)準(zhǔn)陰性雞血清，按以上程序進(jìn)行操作，作為代謝抑制試驗(yàn)的對照。

2.5 PCR擴(kuò)增及測序 根據(jù)雞滑液囊支原體vlhA基因設(shè)計(jì)合成一對引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1050 bp左右，上游引物MS1:5’-CCTACGGGAGGCAGCAGT-3’，下游引物MS2：5’-AGGCAGTCGTGTCCCAAGGTC-3’。按熱裂解法[7]提取模板DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.6 抗菌藥物稀釋 分別稱取各種抗菌藥物溶于適宜稀釋液中，無菌操作配制成濃度為110 μg/mL的原液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 最低抑菌濃度(MIC)的測定 從河南、江蘇、安徽、河北和廣東5省分離鑒定的20株MS，每省隨機(jī)選取1株進(jìn)行MIC測定。MIC的測定方法參照吳清民等[8]并改進(jìn)。根據(jù)不同分離株的顏色變化單位(CCU)以決定接種菌液量(104CCU/mL)。MIC測定：在滅菌試管中分別加入改良Frey氏液體培養(yǎng)基2 mL，14管/組，于每組的第1管依次分別加入上述稀釋并除菌的抗生素各0.5 mL，然后按5倍倍比稀釋至第11管后棄去多余的0.5 mL，接著各孔加入200 μL待測菌液(104CCU/mL)。第l2管作為陰性對照(培養(yǎng)基2 mL)，第13管作為藥物對照(培養(yǎng)基2 mL+抗生素0.5 mL),第14管(培養(yǎng)基2 mL+200 μL待測菌液)不加抗生素作陽性對照。加塞后，置37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。判定結(jié)果：當(dāng)陰性對照孔不變色，陽性對照變?yōu)辄S色，以試驗(yàn)孔不發(fā)生顏色變化(即沒有MS生長)的最小抗生素濃度孔的稀釋度為該藥物對被試菌株的MIC。

3 結(jié)果

3.1 雞滑液囊支原體的分離鑒定

3.1.1 雞滑液囊支原體的分離 對從河南、江蘇、安徽、河北和廣東五省采集的204份樣品進(jìn)行支原體的分離培養(yǎng)，共分離到20株雞滑液囊支原體。分離菌經(jīng)瑞氏染色，在油鏡下呈球形或橢圓形，菌落在固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)為細(xì)小、光滑、致密的小菌落，半凹陷于培養(yǎng)基內(nèi)，在低倍鏡下觀察到菌落形態(tài)為特征性的“煎蛋狀”(圖1)，5省的分離情況見表1。

A:分離菌的瑞氏染色(10×100)；B：分離菌在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(10×10)

表1 五省雞滑液囊支原體的分離情況

3.1.2 雞紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) 分離菌與雞紅細(xì)胞液作用一段時(shí)間后，在低倍顯微鏡下可見菌落表面吸附紅細(xì)胞。

3.1.3 血清學(xué)試驗(yàn) 液體培養(yǎng)物37 ℃培養(yǎng)3代后離心濃縮，平板凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌能夠與MS標(biāo)準(zhǔn)陽性血清呈凝集反應(yīng)，而與MG標(biāo)準(zhǔn)陽性血清不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。

3.1.4 代謝抑制試驗(yàn) 培養(yǎng)至第3天時(shí)，菌液對照管及代謝抑制試驗(yàn)對照管的培養(yǎng)液均變?yōu)辄S色，血清對照管培養(yǎng)液顏色無變化，加有抗血清的第7～8支小管內(nèi)的培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，即其代謝抑制價(jià)為128。

3.1.5 PCR擴(kuò)增及測序 根據(jù)雞滑液囊支原體vlhA基因進(jìn)行擴(kuò)增(圖2)和測序，并將測序結(jié)果與GenBank MSvlhA序列比對，同源性為98.63%。

M. DL2000 DNA Marker；1-5：分離株；6：MS GX11-T株；7：MG CR株；8：陰性對照

3.2 不同地區(qū)臨床分離雞滑液囊支原體對常用抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

3.2.1 MIC的測定 泰樂菌素等12種抗生素對雞滑液囊支原體標(biāo)準(zhǔn)株(MS GX11-T)及雞滑液囊支原體臨床分離株的MIC測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，雞滑液囊支原體標(biāo)準(zhǔn)株和5株臨床分離株均對泰樂菌素比較敏感，MIC值為0.035 μg/mL；替米考星、林可霉素、氟苯尼考、鹽酸土霉素和慶大霉素敏感性次之，MIC值介于0.035～0.176 μg/mL；金霉素、紅霉素、卡那霉素敏感性顯著下降，MIC值介于0.176～0.88 μg/mL；恩諾沙星、氧氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星敏感性較差，MIC值介于0.88～4.4 μg/mL。

表2 泰樂菌素等12種抗菌藥物對雞滑液囊支原體的MIC值 μg/mL

4 討論

本研究從河南、江蘇、安徽、河北和廣東5省肉種雞場疑似雞滑液囊支原體感染的病雞跗關(guān)節(jié)樣品進(jìn)行病原菌的分離與鑒定，分離菌經(jīng)瑞氏染色在油鏡下呈球形或橢圓形，在固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)為細(xì)小、光滑、致密的小菌落，菌落形態(tài)為"煎蛋狀”，結(jié)合進(jìn)一步的代謝抑制試驗(yàn)可確診為雞滑液囊支原體，與徐靜等[9]結(jié)論相符合。雖然支原體的分離鑒定操作難度較大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但結(jié)果可靠準(zhǔn)確，并且能進(jìn)一步進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對臨床用藥具有指導(dǎo)作用。

從本試驗(yàn)結(jié)果看，在泰樂菌素等12種抗生素中，雞滑液囊支原體標(biāo)準(zhǔn)株及5株雞滑液囊支原體臨床分離菌株對泰樂菌素的MIC值均為0.035 μg/mL,劉軼秋等[10]對MS GX11-T株測定的MIC值為0.031 μg/mL，兩者測定的MIC值差異不大，說明不同地區(qū)雞滑液囊支原體對泰樂菌素仍然保持較好的敏感性，與Landman等[11]體外研究發(fā)現(xiàn)17種MS荷蘭本地分離株以及典型株WVU1853均對泰樂菌素敏感的結(jié)果一致，分析可能是因?yàn)樘肪貎r(jià)格較貴，成本高，臨床使用不多，所以才沒有造成雞滑液囊支原體對其產(chǎn)生耐藥性。宋戰(zhàn)勝[12]、曹中贊[13]等認(rèn)為不同菌株對藥物的敏感性存在差異；本研究中江蘇株和安徽株對林可霉素最低抑菌濃度為0.176 μg/mL，而標(biāo)準(zhǔn)株MS GX11-T及其余3株雞滑液囊支原體臨床分離株對林可霉素最低抑菌濃度為0.035 μg/mL，此試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，臨床應(yīng)定期對不同地區(qū)流行株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選用有效的抗菌藥物，以減少耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散。

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(編輯：李文平)

Sensitivity Test ofMycoplasmasynoviaeIsolates from Different Geographical Locations to Common Antimicrobial Drugs

DING Mei-juan1，LU Feng-ying1，YAN Peng1，YIN Xiu-feng1，ZHANG Xiao-fei1,2*

(1.NanjingTianbangBio-IndustryCo.Ltd,Nanjing211102,China； 2.InstituteofVeterinaryMedicine,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China)

In order to investigate the drug resistance ofMycoplasmasynoviae, 20 isolates out of 204 pathologic materials of suspectedMycoplasmasynoviaeinfection in chickens from Henan, Jiangsu, Anhui, Hebei and Guangdong were examined and identified, and the sensitivities of 5 isolates (from 5 different provinces) to 12 common antimicrobial drugs were tested. The results demonstrated that all of the 5Mycoplasmasynoviaeisolates were more sensitive to tylosin, and had different degrees of tolerances to enrofloxacin, ofloxacin, and ciprofloxacin hydrochloride. This paper can provide reference for rational usage of antibiotics in clinic.

Mycoplasmasynoviae; isolation and identification; drug sensitivity test

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目CX(14)2131

丁美娟，助理研究員，從事動(dòng)物傳染病預(yù)防研究。

張小飛。E-mail：xiaofei0804@sina.com

2015-07-11

A

1002-1280 (2015) 10-0052-04

S852.62