基于UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定豬糞便中5種獸藥殘留量的研究

顧欣，張?chǎng)危瑖?yán)鳳，吳劍平，李丹妮

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海201103)

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基于UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定豬糞便中5種獸藥殘留量的研究

顧欣，張?chǎng)?，?yán)鳳，吳劍平，李丹妮

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海201103)

為了建立同時(shí)測(cè)定豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、恩諾沙星、金霉素、泰樂(lè)菌素5種獸藥殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法，樣品經(jīng)McIlvaine-Na2EDTA緩沖溶液提取，C18粉吸附雜質(zhì)，HLB固相萃取小柱凈化，濃縮富集后用0.1%甲酸甲醇溶液復(fù)溶，過(guò)濾上機(jī)，基質(zhì)液外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，5種獸藥在10～500 μg/kg的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，在添加濃度50～500 μg/kg，平均回收率為53%～85%，RSD為1.87%～18.81%。該方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度，能快速、準(zhǔn)確測(cè)定豬糞便中5種獸藥殘留，為養(yǎng)殖環(huán)節(jié)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)獸藥使用情況提供了技術(shù)支持。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；獸藥殘留；豬糞便

目前，國(guó)內(nèi)獸藥殘留量的監(jiān)測(cè)方法多針對(duì)動(dòng)物組織，并不適用于養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的活體監(jiān)測(cè)。由于抗生素藥物進(jìn)入動(dòng)物消化道后，約60%～90%以原形或以代謝物形式經(jīng)畜禽糞便排泄，為了研究和控制生豬養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中的獸藥殘留，豬糞做為一種易獲得的活體檢材具有較高的研究?jī)r(jià)值，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)獸藥使用情況。因此，有必要建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的糞便中的獸藥殘留分析方法。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的糞便中獸藥殘留的分析方法多局限于某一類獸藥[4-5]，而糞便中多類藥物殘留的研究較少，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)糞便樣品中的藥物檢測(cè)缺少相關(guān)依據(jù)。為了加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)用藥情況的監(jiān)管，本文建立了利用固相萃取及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)同時(shí)測(cè)定豬糞便中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類四類常用獸藥，包括二甲氧芐啶(Diaveridine)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(Sulfameter)、恩諾沙星(Enrofloxacin)、金霉素(Chlorotetracycline)、泰樂(lè)菌素(Tylosin)5種常用獸藥殘留的分析方法，該法可操作性強(qiáng)，準(zhǔn)確度與精密度較高，為養(yǎng)殖環(huán)節(jié)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)獸藥使用情況提供了檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(WatersXevoTMTQ MS，ESI+)；電子天平；高速冷凍離心機(jī)；漩渦混勻器；超聲波清洗器；Waters OasisHLB固相萃取柱(3 mL/40 mg)；固相萃取裝置；氮吹儀；0.22 μm針式濾器(水相)。二甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、恩諾沙星、金霉素、泰樂(lè)菌素對(duì)照品(美國(guó)Sigma；純度分別為99%、99%、99.8%、92%、98%)，甲酸、甲醇、乙腈(色譜純)；氨水、醋酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸鈉、檸檬酸(分析純)；高純氮；高純氬；親水性C18粉；實(shí)驗(yàn)用水均為一級(jí)水。

1.2 溶液配置 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密稱取5種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品，用適量甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度各為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冷藏保存，有效期6個(gè)月；樣品提取液：Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH4.0，現(xiàn)配現(xiàn)用；定容液：0.1%甲酸甲醇水溶液(85/15，V/V)，準(zhǔn)確量取15mL甲醇，加入85mL0.1%甲酸水溶液，充分混合即得。

1.3 前處理方法 將采集的新鮮糞便樣品，充分?jǐn)噭颍胖迷?18℃冰箱冷凍。稱取未完全解凍的豬糞便樣品1g(精確至0.01g)于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入C18粉0.5g及McIlvaine-EDTA緩沖液10mL，充分振蕩10min，4℃下10000r/min離心10min，移出上清液。重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，備用。

HLB固相萃取小柱(3mL/40mg)用3mL甲醇，3mL水活化。取備用液4mL過(guò)柱，依次用 3mL5%甲醇溶液淋洗，3mL甲醇洗脫。收集洗脫液于40 ℃水浴下用氮?dú)獯抵两?，?.0mL0.1%甲酸甲醇水溶液(85/15，V/V)溶解殘?jiān)芤哼^(guò)0.22μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品的配置 稱取五份空白豬糞便樣品各1g(精確至0.01g)，按照1.3項(xiàng)下提取、凈化、氮?dú)獯蹈珊螅謩e加入1μg/mL的5種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品混合工作液10、25、50、100、500μL，再用0.1%甲酸甲醇水溶液(85/15，V/V)定容至1mL，渦旋充分溶解殘?jiān)?，配制成質(zhì)量濃度范圍為10、25、50、100、500μg/kg的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.5 儀器條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱：AgilentSBC181.8μm2.1mm×100mm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液；流速：0.3mL/min，優(yōu)化的色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧正離子源；電離模式：正離模式(ESI+)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)；電離電壓：3.5 kV；錐孔溫度：500 ℃；脫溶劑氣流：800 L/Hr；反吹氣(氮?dú)?：50 L/Hr；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 5種獸藥的定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照1.4操作步驟，配制成質(zhì)量濃度為10、25、50、100、500 μg/kg的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，以定量離子對(duì)相應(yīng)的色譜峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制5種獸藥的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：5種藥物在10～500 μg/kg質(zhì)量濃度范圍線性良好，線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。5種獸藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖見圖1。

表3 5種獸藥的基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 準(zhǔn)確度與精密度 選取空白糞便樣品，準(zhǔn)確加入一定質(zhì)量濃度的5種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)以考察方法的準(zhǔn)確度與精密度。在空白糞便中5種獸藥各添加高、中、低三個(gè)含量水平。添加樣品按確定的步驟(1.3)處理并測(cè)定，批內(nèi)相同的質(zhì)量濃度水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三個(gè)批次。測(cè)定結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，豬糞中二甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶在三個(gè)含量水平下的回收率為72.16%～83.52%，恩諾沙星在三個(gè)含量水平下的回收率為66.80%～82.08%，金霉素、泰樂(lè)菌素在三個(gè)含量水平下的回收率為53.04%～84.08%。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)均在4.18%～18.81%之間，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)均在1.87%～17.27%之間。結(jié)果表明該方法具有較為良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表4 豬糞便中5種獸藥批內(nèi)、批間回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖1 5種獸藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè) 隨機(jī)抽取某養(yǎng)殖場(chǎng)的6個(gè)糞便樣品，采用建立的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，每份樣品做2次平行測(cè)定，結(jié)果取平均值，檢測(cè)結(jié)果匯總見表5。檢測(cè)結(jié)果顯示：金霉素、泰樂(lè)菌素、恩諾沙星在實(shí)際豬糞便樣品中的檢出率分別達(dá)到100%、33.3%、33.3%。

3 討論與小結(jié)

3.1 提取方法的選擇 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1-3]，磺胺類、氟喹諾酮類[4-5]藥物可溶于極性有機(jī)溶劑、親水性有機(jī)酸或有機(jī)堿、酸/堿水溶液，對(duì)提取液的要求不高，而大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類藥物易與畜禽糞便中大量的金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)，并與糞便中的蛋白質(zhì)發(fā)生鍵合[6]，需采用McIlvaine-Na2EDTA緩沖溶液作為提取液，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金屬離子，同時(shí)采用C18粉吸附沉淀糞便中的雜質(zhì)，保證四類藥物的游離性。結(jié)果證明，McIlvaine-Na2EDTA緩沖溶液提取液可以實(shí)現(xiàn)對(duì)5種抗生素的同時(shí)提取。在對(duì)實(shí)際樣品的分析中發(fā)現(xiàn)，親水性C18粉可以吸附提取液中懸浮的基質(zhì)物質(zhì)，使上清液更為清澈；疏水性C18粉起不到凈化效果，且不利于下一步的固相萃取操作。同時(shí)，結(jié)果表明，過(guò)量的C18粉會(huì)對(duì)金霉素、泰樂(lè)菌素有一定的吸附作用，這與金霉素、泰樂(lè)菌素在C18色譜柱上的保留特性一致；而不加或較少的加入C18粉，會(huì)導(dǎo)致固相萃取柱堵塞。

表5實(shí)際樣品中5種獸藥的檢測(cè)結(jié)果表

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3.2 基質(zhì)效應(yīng)的影響 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析目標(biāo)化合物時(shí)，分析物的共流出組分會(huì)影響電噴霧接口處的離子化效率從而導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，并表現(xiàn)為增強(qiáng)或抑制作用。豬糞便質(zhì)地較細(xì)，是一種成分復(fù)雜的生物樣品基質(zhì)，含有有機(jī)質(zhì)15%，對(duì)5種獸藥的測(cè)定存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)影響，本實(shí)驗(yàn)使用基質(zhì)液配置標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，以消除基質(zhì)對(duì)結(jié)果的影響，但仍無(wú)法消除基質(zhì)對(duì)恩諾沙星、金霉素、泰樂(lè)菌素的吸附作用，因此要消除基質(zhì)效應(yīng)，還應(yīng)在前處理方法上進(jìn)行改進(jìn)。本文采取了三個(gè)措施盡可能多的去除掉基質(zhì)，取得了較好的效果，一是將樣品進(jìn)行冷凍后分析，并在低溫下離心樣品提取液；二是將提取液調(diào)成酸性，并加入適量的C18粉；三是上樣后先用5%甲醇溶液淋洗SPE柱再洗脫，洗脫液不選乙腈，而選擇洗脫能力較弱的甲醇。

3.3 小結(jié) 本文建立了同時(shí)測(cè)定豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、恩諾沙星、金霉素、泰樂(lè)菌素5種獸藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法?；诒痉椒▽?duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，在飼喂過(guò)獸藥的動(dòng)物糞便樣品中，獸藥原型的含量已達(dá)到本方法可檢測(cè)的線性范圍，該方法具有快速、定性、定量、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可用于豬糞便中5種獸藥殘留的定量測(cè)定。

[1] 張春燕. 不同環(huán)境基質(zhì)中抗生素和藻毒素的UPLC/MS/MS分析方法建立與應(yīng)用[D].河北師范大學(xué),2013.

[2] 吳劍平,張?chǎng)?李丹妮,等. 五種抗菌藥物從豬、雞飼料至有機(jī)肥中的藥物殘留遷移規(guī)律研究[J]. 中國(guó)獸藥雜志,2015,05:43-48.

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(編輯：陳希)

Simultaneous Determination of Five Veterinary Drug Residuesin Swine Manure by Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

GU Xin, ZHANG Xin,YAN Feng,WU Jian-ping,LI Dan-ni

(ShanghaiVeterinaryDrugsandFeedstaffsControlinstitute，Shanghai201103,China)

A method for simultaneously detecting Diaveridine,Sulfameter, Enrofloxacin,Chlorotetracycline and Tylosin in swine manureby ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was developed. After having been extracted with McIlvaine-Na2EDTA buffer solution, the sample was purified and concentrated by C18 power and HLB solid phase extraction column. The residue was dissolved by 0.1% formic acid/methanol (85/15).The results showed that five veterinary drugs were determined with a fine linear relationship from 10 to 500μg/kg.There coveries of five veterinary drugs spiked with 50～500 g/kg in swine manure were from 53%～85%withRSDsranging from 1.87% to 18.81%. As a result, the method is seized of high accuracy as well as sensitivity for a rapid determination of fiveveterinary drugs in swine manure.

ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);veterinary drug residues; swine manure

上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃(滬農(nóng)青字(2014)第2-5號(hào))；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字(2014)第3-3號(hào))

顧欣，碩士，研究員，從事獸藥飼料及畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)方面研究。E-mail: guxun@sh163.net

2015-08-03

A

1002-1280 (2015) 10-0032-04

S859.796